http://hdl.handle.net/10366/68517 2013-05-25T14:25:09Z 2013-05-25T14:25:09Z Vaquero Rodríguez, Javier http://hdl.handle.net/10366/121427 2013-05-08T07:06:28Z 2012-12-31T23:00:00Z

Título : Papel del receptor nuclear de ácidos biliares NR1H4 (“farnesoid X receptor”, FXR) en el control de la expresión de genes implicados en el desarrollo de quimiorresistencia. Características funcionales de sus isoformas Autor(es) : Vaquero Rodríguez, Javier Resumen : [ES] El descubrimiento de receptores específicos de membrana (como TGR5) y nucleares (como FXR) sensibles a la activación por ácidos biliares ha hecho que se reconozca la función de estas moléculas no sólo como meros detergentes digestivos sino también como moléculas señalizadoras implicadas en el control de diversas facetas del metabolismo. En este sentido, varios estudios han encontrado conexiones entre las vías de señalización intracelular relacionadas con los ácidos biliares y los procesos de proliferación y diferenciación en las células expuestas a estos compuestos, lo que concuerda con la observación de que existe un mayor riesgo de carcinogénesis en tejidos y órganos del circuito enterohepático (normalmente expuestos a concentraciones más elevadas de ácidos biliares) en ratones que no expresan FXR. Por otra parte, existen evidencias de la implicación de FXR en mecanismos de respuesta a la agresión química causada por sustancias exógenas, que determina que las células sanas sean más resistentes a las sustancias cancerígenas y las células tumorales sean más resistentes a la quimioterapia. Esto sugiere que FXR puede formar parte de un sistema más complejo de defensa celular al estrés químico, similar al sistema SOS muy conservado en bacterias, existen evidencias de la implicación en mecanismos de respuesta a la agresión química causada por sustancias exógenas, que determina que las células sanas sean más resistentes a las sustancias cancerígenas y las células tumorales sean más resistentes a la quimioterapia. Además, existen cuatro isoformas de este receptor nuclear cuya expresión parece ser específica de cada tejido, pero de las que se conoce muy poco sobre sus funciones específicas. Por ello, en esta Tesis Doctoral se han utilizado técnicas de biología molecular y cultivos celulares para abordar diferentes objetivos dirigidos a profundizar en el conocimiento de las características funcionales de las diferentes isoformas de FXR y su papel en el desarrollo de mecanismos de resistencia a la quimioterapia antitumoral en tumores del circuito enterohepático. La conclusión global obtenida tras el estudio es que: FXR está implicado en la activación de mecanismos de respuesta a la agresión química causada por sustancias endógenas y exógenas. Así, FXR puede formar parte de un complejo sistema de defensa celular al estrés químico, similar al sistema SOS que está muy conservado en bacterias. En células hepáticas e intestinales sanas, FXR puede jugar un papel de protección frente a sustancias genotóxicas y por lo tanto potencialmente cancerígenas, mientras que en las células tumorales FXR puede favorecer su mayor resistencia a la quimioterapia; [EN] The discovery of specific membrane receptors (as TGR5) and nuclear (as FXR) responsive to activation by bile acids has been recognized as having the function of these molecules is not merely as digestive detergents but also as signaling molecules involved in the control of various aspects of metabolism. In this respect, several studies have found connections between the intracellular signaling pathways associated with bile acids and processes of proliferation and differentiation in cells exposed to these compounds, which agrees with the observation that there is an increased risk of carcinogenesis tissues and organs of the enterohepatic circulation (usually exposed to higher concentrations of bile acids) on FXR knockout mice. Moreover, there is evidence of the involvement of FXR in response mechanisms to chemical attack caused by exogenous substances, which determines that healthy cells are more resistant to carcinogens and tumor cells more resistant to chemotherapy. This suggests that FXR may be part of a more complex cellular defense to chemical stress, similar to the highly conserved SOS system in bacteria, there is evidence of involvement in mechanisms of response to chemical attack caused by exogenous substances, which determines the Healthy cells are more resistant to carcinogens and tumor cells more resistant to chemotherapy. In addition, there are four isoforms of this nuclear receptor whose expression appears to be tissue specific, but which very little is known about their specific functions. Therefore, in this thesis have been used molecular biology techniques and cell culture to address different objectives to deepen the understanding of the functional characteristics of the different isoforms of FXR and its role in the development of mechanisms of resistance to chemotherapy antitumor tumors enterohepatic circulation. The overall conclusion obtained after the study is that: FXR is involved in the activation of response mechanisms to chemical attack caused by endogenous and exogenous substances. Thus, FXR can be part of a complex cellular defense system to chemical stress, similar to the SOS system that is highly conserved in bacteria. And bowel in healthy liver cells, FXR may play a role in protection against genotoxic substances and therefore potentially carcinogenic, while FXR tumor cells can contribute to their increased resistance to chemotherapy

2012-12-31T23:00:00Z Sacristán López, Carlos http://hdl.handle.net/10366/121418 2013-05-07T10:17:25Z 2011-12-31T23:00:00Z

Título : Regulación del tráfico intracelular de la actividad Quitín Sintasa III en Saccharomyces cerevisiae Autor(es) : Sacristán López, Carlos Resumen : [ES] La pared celular de levaduras está compuesta por una serie de capas, entre las cuales se encuentra la quitina. Este compuesto, a pesar de ser minoritario, es esencial para la viabilidad de Saccharomyces cerevisiae. Chs3 es la subunidad catalítica de la actividad Quitín Sintasa III (QSIII) y es responsable de la síntesis de la mayor parte de la quitina presente en la pared celular. Esta proteína presenta una regulación muy compleja que va a permitir que se localice en el cuello de la levadura durante momentos muy discretos del ciclo celular. Dicha regulación tiene lugar a nivel a nivel postraduccional y es mediada por una serie de proteínas que se han denominado Chs (de Chitin synthesis). En ausencia de las mismas Chs3 es incapaz de alcanzar la membrana plasmática, quedando retenida en diferentes compartimentos intracelulares de la ruta de secreción dependiendo del mutante. Esta regulación tan compleja de Chs3 ha hecho que haya sido ampliamente estudiada como modelo del tráfico intracelular regulado de proteínas. En este trabajo nos propusimos como primer objetivo profundizar en el estudio de la estructura-función de los distintos dominios de Chs3. Hemos visto que Chs3 es una proteína capaz de formar dímeros en el retículo endoplasmático a través de su extremo N-terminal. La adquisición de la estructura cuaternaria por parte de Chs3 es un proceso altamente regulado, de manera que los monómeros que se escapan del retículo endoplasmático son devueltos al mismo en vesículas COPI, participando la proteína Rer1 en este sistema de control de calidad. Además, la oligomerización de Chs3 es una conformación importante para la correcta cristalización de la quitina. Por otra parte, el dominio C-terminal desempeña tres funciones: es necesario para la interacción con la subunidad Chs6 del exómero, una maquinaria necesaria para la salida de Chs3 desde el trans-Golgi Network (TGN) hacia la membrana plasmática; media el retorno de los monómero de Chs3 desde el cis-Golgi hacia el retículo endoplasmático en vesículas COPI; y es imprescindible para la propia actividad catalítica. Finalmente, el dominio globular central, donde reside el centro catalítico, también está implicado en la regulación del tráfico intracelular de Chs3. Un segundo objetivo ha sido profundizar en la función de Chs4, la proteína que activa y localiza a Chs3 en la membrana plasmática. Trabajo previo en el laboratorio había demostrado que Chs4 estabiliza a Chs3 en el cuello de la membrana plasmática impidiendo su endocitosis. En este trabajo hemos descrito que esto es posible gracias a la existencia de un compartimento en el cuello, en el cual reside Chs3 y donde otras proteínas de la membrana plasmática que no están polarizadas se encuentran excluidas. Este compartimento está definido por dos anillos concéntricos, correspondientes con el anillo de septinas y un anillo constituido por la maquinaria endocítica que se dispone perifericamente al primero y en forma de parches. Chs3 sería transportada de forma polarizada hacia la región de membrana delimitada entre ambos anillos, mediando Chs4 el anclaje a las septinas. Este anclaje prevendría el acceso de Chs3 a la maquinaria endocítica dispuesta en la periferia. Eventualmente, se produciría la liberación de las moléculas Chs3 de las septinas, de manera que podrían difundir por el compartimento delimitado en el cuello, hasta entrar en contacto con los parches de endocitosis que median la internalización de Chs3. Durante el crecimiento hiperpolarizado de conjugación, sin embargo, hay un desacoplamiento entre las septinas y la región de endocitosis, de manera que la polarización de Chs3 durante la conjugación es independiente de endocitosis.; [EN] The yeast cell wall is composed of a series of layers, among which is chitin. This compound, although the minority, is essential to the viability of Saccharomyces cerevisiae. Is the catalytic subunit Chs3 activity Quitín synthase III (QSIII) and is responsible for the synthesis of most of the chitin present in the cell wall. This protein has a highly complex regulation will allow localized in the neck during very discrete yeast cell cycle. Such regulation occurs at a post translational level and is mediated by a series of proteins which have been termed Chs (Chitin synthesis). In their absence Chs3 is unable to reach the plasma membrane, being retained in intracellular compartments secretory pathway depending mutant. This regulation so complex Chs3 has made has been widely studied as a model of regulated intracellular protein trafficking. In this paper we set as its first objective to deepen the study of the structure-function Chs3 different domains. Chs3 seen that a protein capable of forming dimers in the endoplasmic reticulum through its N-terminal. Acquiring by quaternary structure Chs3 is a highly regulated process, so that the monomers escaping the endoplasmic reticulum are reimbursed in COPI vesicles participating in this Rer1 protein quality control system. Furthermore, Chs3 oligomerization is important for proper conformation of chitin crystallization. Moreover, the C-terminal domain has three functions: it is necessary for interaction with the exómero Chs6 subunit, an engine output required for the Chs3 from the trans-Golgi Network (TGN) to the plasma membrane, half the return Chs3 the monomer from the cis-Golgi to the ER in COPI vesicles, and is essential for catalytic activity itself. Finally, the central globular domain, where resides the catalytic center is also involved in the regulation of intracellular trafficking Chs3. A second objective was to investigate the role of cHS4, the active protein that localizes to the plasma membrane Chs3. Previous work in the laboratory had shown that cHS4 Chs3 stabilizes the neck of the plasma membrane preventing their endocytosis. In this paper we described that this is possible thanks to the existence of a compartment in the neck, which resides Chs3 and where other plasma membrane proteins that are excluded are polarized. This compartment is defined by two concentric rings with the corresponding septin ring and a ring formed by the endocytic machinery which provides the first and peripherally in the form of patches. Chs3 be transported in a polarized manner into membrane region delimited between the two rings, cHS4 mediating anchoring to the septin. This anchor Chs3 prevent access of the endocytic machinery disposed at the periphery. Eventually occur release of molecules Chs3 septin so that could diffuse the compartment delimited by the collar, to contact patches endocytosis mediating internalization Chs3. Hyperpolarized growth during conjugation, however, there is a decoupling between the septin and endocytosis region, so that the polarization of Chs3 during conjugation is independent of endocytosis.

2011-12-31T23:00:00Z Risueño Pérez, Alberto http://hdl.handle.net/10366/121408 2013-05-10T11:52:05Z 2012-11-30T23:00:00Z

Título : Bioinformática aplicada a estudios del transcriptoma humano: análisis de expresión de genes, isoformas génicas y ncRNAs en muestras sanas y en cáncer Autor(es) : Risueño Pérez, Alberto Resumen : [ES] Este trabajo tiene como base profundizar en el análisis de datos de microarrays de expresión producidos por la empresa Affymetrix, y la introducción de mejoras que permitan ampliar el conocimiento biológico. 1a.- Mejora del método de análisis de datos de microarrays sustituyendo la anotación original proporcionada por Affymetrix por una anotación alternativa, actualizada y centrada en las entidades biológicas; que tome como referencia los genes, transcritos y exones definidos en las bases de datos genómicas más actuales. 1b.- Integración de los datos generados en el objetivo anterior en una plataforma web interactiva con un navegador genómico que permite explorar y visualizar de modo simple tanto la estructura de los loci génicos, como el mapeo de sondas de todos los microarrays de Affymetrix y ciertos datos de expresión de genes. 2.- Desarrollo y aplicación de un análisis de expresión diferencial para identificar genes marcadores en varios conjuntos de datos de muestras de cáncer y para reconocimiento robusto de microRNAs (miRNAs) en datos de mieloma múltiple. 3.- Diseño y desarrollo de nuevo algoritmo que permite la identificación robusta de splicing alternativo en los genes a partir de datos obtenidos con microarrays de exones (Exon 1.0 Affymetrix). Aplicación de dicho algoritmo a un conjunto de muestras de cáncer. 4.- Desarrollo de un estudio transcriptómico global de coexpresión de genes humanos basado en datos de microarrays obtenidos para varias series de muestras de tejidos sanos. Identificación de conjuntos de genes que coexpresan, así como reconocimiento de genes específicos de tejido (tissue-specific genes, TSg) y genes generales de mantenimiento (house-keeping genes, HKg). Estudio evolutivo de ambos tipos de genes analizando su conservación en distintas especies; [EN] This work is based on in-depth analysis of microarray expression data produced by the company Affymetrix, and improvements that expand biological knowledge. 1a. - Improved method of microarray data analysis by replacing the original annotation provided by Affymetrix annotation for alternative, updated and focused on biological entities, that is linked to genes, transcripts and exons defined in the genomic databases more current. 1b. - Integration of data generated in the previous objective interactive web platform with a browser for exploring genomic single mode and display both the structure of the gene loci as probes to map all Affymetrix microarrays and certain gene expression data. 2. - Development and implementation of a differential expression analysis to identify marker genes in several data sets for cancer samples and robust recognition of microRNAs (miRNAs) in multiple myeloma data. 3. - Design and development of new algorithm allows robust identification of alternative splicing in genes from microarray data obtained exons (Exon 1.0 Affymetrix). Applying the algorithm to a set of samples of cancer. 4. - Development of a global transcriptomic study coexpression of human genes based on microarray data obtained for several series of healthy tissue samples. Identification of sets of genes co-expressed, as well as recognition of tissue specific genes (tissue-specific genes, TSG) and general maintenance genes (house-keeping genes, HKG). Evolutionary study analyzing the two types of genes in different species conservation

2012-11-30T23:00:00Z Refolio Carnicero, Esther Hortensia http://hdl.handle.net/10366/121405 2013-05-08T10:19:46Z 2012-12-31T23:00:00Z

Título : Función meiótica de la proteína Ddc2 de Saccharomyces cerevisiae Autor(es) : Refolio Carnicero, Esther Hortensia Resumen : [ES] En la mayoría de los organismos eucariotas con reproducción sexual, la recombinación meiótica es un proceso crucial para la correcta producción de gametos. La recombinación meiótica se inicia con roturas de doble cadena en el DNA (DSBs) que, aún siendo necesarias para la correcta segregación de los cromosomas en la meiosis, suponen un elevado riesgo para el mantenimiento de la integridad del genoma. Si las células inician la segregación cromosómica antes de que estas roturas hayan sido reparadas, los cromosomas o fragmentos de éstos pueden perderse o segregar incorrectamente. En los organismos eucariotas, existen unos mecanismos de vigilancia o checkpoints que responden a la presencia de DSBs y detienen la progresión del ciclo celular para dar tiempo a la célula para repararlas. Por tanto, los checkpoints tienen un papel crucial en proteger la integridad genómica. Existe un mecanismo de vigilancia específico de la meiosis, denominado checkpoint de recombinación meiótica o de paquitene, que bloquea la progresión de la meiosis en respuesta a fallos meióticos, como por ejemplo la presencia de DSBs sin reparar, y asegura la segregación correcta de los cromosomas. Los errores en la segregación meiótica de cromosomas originan gametos aneuploides que pueden causar diversas patologías. La finalidad de este proyecto de tesis ha consistido en entender mejor los mecanismos moleculares que controlan la función del checkpoint de recombinación meiótica en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. Para ello, hemos estudiado la función de la proteína Ddc2 en el checkpoint de recombinación meiótica. Ddc2 junto con Mec1 constituyen un complejo sensor del daño en el DNA en células vegetativas,. Hemos determinado que Ddc2 participa en el checkpoint de recombinación meiótica puesto que su deleción suprime el bloqueo meiótico que sufren diferentes mutantes de sinapsis y/o recombinación, como sae2, dmc1, hop2 y zip1, originando productos meióticos inviables. La producción de Ddc2 se induce en la profase meiótica y la proteína se hiperfosforila en respuesta a la acumulación de DSBs sin reparar. Sin embargo, los sitios consenso de fosforilación por Mec1 (S/T-Q) no son necesarios para su función de checkpoint. Mediante estudios de microscopía de fluorescencia y de inmunoprecipitación de cromatina, hemos demostrado que Ddc2 se localiza en forma de focos múltiples, que se acumulan en los mutantes meióticos de forma dependiente de RPA señalizando la presencia de intermediarios de recombinación sin reparar. Además, hemos detectado una localización alternativa de Ddc2, independiente de la recombinación, en el huso de la profase meiótica. Se ha descrito que en el mutante sae2 de S. cerevisiae no existe procesamiento nucleolítico de las DSBs meióticas; sin embargo, inesperadamente, hemos observado focos meióticos de Ddc2 en sae2 lo que, en principio, implicaría la existencia de regiones de ssDNA. Diversas evidencias, como la generación de focos de RPA y de BrdU, así como la activación de la kinasa efectora Mek1 de forma dependiente de Spo11, confirman la formación de ssDNA derivado de DSBs meióticas en sae2. Proponemos que una fracción de las DSBs meióticas generadas se procesa por un mecanismo alternativo independiente de Sae2 y de otras proteínas descritas hasta el momento implicadas en la resección de DSBs, como Exo1 y Sgs1. Nuestros resultados con el estudio de Ddc2 durante la meiosis en levaduras nos han permitido avanzar en el conocimiento de cómo el checkpoint de recombinación meiótica es capaz de detectar la existencia de errores y detener la progresión de la meiosis. Puesto que ATRIP, la proteína homóloga de Ddc2 en mamíferos, se localiza en cromosomas meióticos es probable que esta función esté conservada en la evolución; [EN] In most sexually reproducing eukaryotic organisms, meiotic recombination is a process crucial for proper production of gametes. Meiotic recombination is initiated by double-strand breaks in DNA breaks (DSBs) which, although necessary for the correct segregation of chromosomes at meiosis, pose a high risk for maintaining genome integrity. If cells chromosome segregation start before these cracks have been repaired, chromosomes or fragments thereof may be lost or improperly segregate. In eukaryotic organisms, there are mechanisms or checkpoints surveillance responsive to the presence of DSBs and stop the progression of the cell cycle to allow time for the cell to repair. Therefore, the checkpoints have a crucial role in protecting genomic integrity. There is a specific monitoring mechanism of meiosis, called checkpoint or pachytene meiotic recombination, which blocks the progression of meiosis in meiotic fault response, such as the presence of DSBs unrepaired, and ensures the proper segregation of chromosomes . Errors in meiotic chromosome segregation originate Aneuploid gametes can cause various diseases. The purpose of this thesis has been to better understand the molecular mechanisms that control the function of the meiotic recombination checkpoint in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. To do this, we studied the Ddc2 protein function in meiotic recombination checkpoint. Ddc2 with Mec1 sensor is a complex DNA damage in vegetative cells. We have determined that Ddc2 participates in the meiotic recombination checkpoint since its deletion suppresses blocking meiotic mutants suffer different synapses and / or recombination, as SAE2, dmc1, and zip1 hop2, creating viable meiotic products. Ddc2 production is induced in meiotic prophase and the protein is hyperphosphorylated in response to the accumulation of DSBs unrepaired. However, consensus phosphorylation sites Mec1 (S / TQ) are not required for checkpoint function. By fluorescence microscopy studies and chromatin immunoprecipitation, we demonstrated that locates Ddc2 as multiple foci, which accumulate in meiotic mutants RPA dependently signaling the presence of recombination intermediates unrepaired. Furthermore, we have found an alternative location of Ddc2 independent recombination, on the spindle of meiotic prophase. Described in the mutant S. SAE2 cerevisiae there nucleolytic processing of meiotic DSBs, but unexpectedly, we have observed in outbreaks SAE2 Ddc2 meiotic which in principle implies the existence of regions of ssDNA. Several lines of evidence, including the generation of pockets of RPA and BrdU, and activation of the effector kinase Mek1 Spo11-dependent manner, confirming the formation of ssDNA derivative SAE2 meiotic DSBs. Propose that a fraction of the generated meiotic DSBs are processed by an alternative mechanism independent SAE2 and other proteins described so far involved in resecting DSBs as Exo1 and Sgs1. Our results with the study of Ddc2 during meiosis in yeast have allowed us to advance our knowledge of how the meiotic recombination checkpoint is able to detect the existence of errors and stop the progression of meiosis. Since ATRIP protein Ddc2 counterpart in mammals, is localized in meiotic chromosomes is likely that this function is conserved in evolution

2012-12-31T23:00:00Z