Estudio estructural de las serin proteinasas

1. Quimotripsina

La quimotripsina que vamos a estudiar es la forma

La g-quimotripsina es el producto primario de la acción de la tripsina sobre el correspondiente zimógeno, quimotripsinógeno, en la activación de la quimotripsina pancreática. Esta activación consiste en la rotura proteolítica, con pérdida de algunos aminoácidos, en los residuos 14-15 y 146-147, de lo que resulta que la g-quimotripsina consta de tres cadenas unidas por puentes disulfuro: La cadena A, de 13 aminoácidos: la cadena B, de 130: y la cadena C, de 194:

El sitio catalítico está formado por la tríada Ser-His-Asp:

Al que está unido el marcador de afinidad N-Acetil-L-Ala-L-Phe-cloroetilcetona:

La estructura de la g-quimotripsina está estabilizada por diversos enlaces disulfuro (lo que es bastante común en proteínas extracelulares):

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2. Trombina

La trombina es una serinproteinasa producida por la rotura de la protrombina por el complejo protrombinasa:

que a su vez escinde la molécula de fibrinógeno para producir el monómero de fibrina, todo ello en el proceso de coagulación de la sangre.

El sitio catalítico:

Marcador de afinidad unido al sitio catalítico:

Otros ligandos:

Iones de sodio:

Péptido inhibitorio:

Puentes disulfuro:

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3. Subtilisina

Una serin proteinasa de origen bacteriano es la

El sitio catalítico:

Iones de calcio fundamentales en la acción catalítica:

Residuos que interaccionan con el Ca++:

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4. Mecanismo catalítico de las serin proteinasas

Las serin proteinasas presentan un mecanismo catalítico bien conocido, compartido por otras enzimas no necesariamente proteolíticas. Este mecanismo consiste en una fase de acilación en la que se forma un intermediario covalente acil-enzima, con liberación del primer producto, y una fase de desacilación en la que una molécula de agua rompe el intermediario con liberación del segundo producto. Todas estas enzimas tienen un centro activo formado por tres aminoácidos absolutamente conservados, Serina, Histidina y Aspartato, conjunto que recibe el nombre de Tríada catalítica::

Al centro activo de la enzima se une el substrato: ; en este caso, se representa como substrato un cromógeno muy utilizado en los ensayos de quimotripsina, la N-succinil-L-fenilalanina 4-nitroanilida:

Se trata de un aminoácido aromático (Phe) N-sustituído (lo que remeda el resto de la cadena polipeptídica hacia el N-término) unido por enlace amida a 4-nitroanilina. Este último enlace es el susceptible al ataque por quimotripsina, lo que libera el cromógeno (4-nitroanilina) de forma que la reacción puede seguirse fácilmente por fotometría.

La unión da lugar al complejo enzima-substrato: ; La especificidad se logra dado que el anillo aromático de la fenilalanina va a ocupar un sitio específico sobre la superficie de la enzima (no representado).

La acción catalítica comienza cuando His 57 retira un protón del grupo alcohólico de la serina, quedando la histidina en forma de imidazolio, con carga positiva (en azul en el modelo) y la serina como enolato, con carga negativa (en rojo en el modelo), tal como puede apreciarse en la imagen del complejo: ;

El enolato es un nucleófilo potente que va a atacar al grupo carbonilo (C=O) del enlace escindible, dando lugar al Estado de transición 1: ; en el que se observa un intermediario tetraédrico (así llamado porque el carbono sp2 del grupo carbonilo del enlace escindible se convierte transitoriamente en un carbono sp3, tetraédrico).

A continuación, la histidina 57 cede su protón a este complejo, con lo que se separa el primer producto (4-nitroanilina) y el complejo queda como Acil-enzima y primer producto:

Tras la retirada del primer producto, el complejo Acil-enzima queda listo para comenzar la segunda fase de la reacción:

Ésta tiene lugar por la entrada de una molécula de agua (el segundo substrato) al centro activo, dando lugar al Complejo Acilenzima - H2O:

La histidina 57 retira entonces un protón de la molécula de agua, que queda convertida en un ion hidroxilo (OH-); el conjunto Acilenzima, imidazolio e hidroxilo que se forma es análogo al conjunto substrato, imidazolio y enolato que veíamos en la fase de acilación: ;

El ion hidroxilo es un nucleófilo que ataca al acilenzima dando lugar al Estado de transición 2 (fase de desacilación) en el que nuevamente vemos que el grupo carbonilo del enlace escindible pasa transitoriamente a ser sp3, de geometría tetraédrica:

Este segundo estado de transición se resuelve con la Salida del producto 2 (N-succinil-L-fenilalanina):

Por último, el grupo imidazolio de la histidina cede su protón al enolato de la serina, con lo cual tiene lugar la vuelta al estado inicial:

El papel del aspartato, según se cree, es la estabilización del imidazolio de la histidina.




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