II. Otras enzimas que participan en el sistema de la glucógeno fosforilasa

La glucógeno fosforilasa es el término de una cascada de activaciones que tiene su origen en una señal química extracelular (p.e., catecolaminas o glucagon) que en el interior de la célula sigue una trayectoria compleja: Activación de proteínas G - Activación de adenilato ciclasa - Protein kinasa A (activada por cAMP) - Activación de fosforilasa kinasa - Activación de fosforilasa por fosforilación. Los mecanismos moleculares de los distintos pasos de esta cascada no se conocen con un detalle comparable a la activación de la fosforilasa que acabamos de ver. No obstante, algo se conoce sobre la estructura molecular de las enzimas o sistemas mencionados, que pasamos a ver a continuación.

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II.1 Fosforilasa kinasa

La fosforilasa kinasa cataliza la activación de la fosforilasa a expensas de ATP que fosforila al residuo Ser 14 según hemos visto antes. La fosforilasa kinasa es una enzima muy compleja, y su estructura cuaternaria es (abgd)4, es decir, un hexadecámero. Las subunidades a y b son de naturaleza regulatoria; la subunidad g es catalítica y la subunidad d es la calmodulina (lo cual da al sistema la posibilidad de ser activado asimismo por Ca++. Disponemos de la estructura molecular parcial de la subunidad g. Se trata del dominio catalítico propiamente dicho, y comprende los residuos 14-289 de la subunidad g. La subunidad completa consta de 386 residuos. Los que ocupan las posiciones 302-326 y 342-366 son dominios de fijación de calmodulina (que es la subunidad subunidad d de la fosforilasa kinasa). La estructura del dominio representado muestra, a su vez, un subdominio N-terminal a/b: y otro C-terminal de tipo todo- a:

Se representa asimismo en esta estructura un substrato peptídico de la fosforilasa kinasa, el péptido RQMSFRL: cuya Ser 4 puede ser fosforilada por la enzima:

La proteína ha sido cristalizada en presencia del otro substrato ATP, , cuyo fosfato g está adyacente al -OH de la serina del substrato; y presenta asimismo un ion Mn++, que forma parte d el complejo ATP-Mn++ que es el verdadero substrato de la enzima.

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II.2 Calmodulina

La calmodulina es una proteína pequeña, de secuencia muy conservada (es prácticamente idéntica en todos los vertebrados) que media las acciones del ion Ca++. Como hemos visto arriba, la subunidad d de la fosforilasa kinasa es la calmodulina. Cuando esta proteína fija Ca++, tiene lugar un cambio conformacional que se transmite a las proteínas con las cuales interacciona la calmodulina. Cada molécula es capaz de fijar cuatro iones Ca++, cada uno de loscuales se fija a un motivo estructural propio de todas las proteínas que fijan este ion, la llamada mano EF.

Vemos en pantalla las estructuras de Complejo Ca++-Calmodulina, a la izquierda, y Calmodulina libre de calcio, a la derecha. La comparación entre ambas nos muestra la magnitud del cambio conformacional inducida por el Ca++.

Hay cuatro iones de Ca++ fijados por molécula: . La unión tiene lugar al motivo en mano EF, . La mano EF consta de dos tramos en a-hélice separados por una zona sin estructura secundaria, en la que hay presentes varios aminoácidos dicarboxílicos:

Podemos comparar con los correspondientes residuos en la calmodulina libre de calcio:

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II.3 Protein kinasa A, Ser/Thr protein kinasa dependiente de cAMP

Se trata asimismo de una enzima compleja en su estructura. Consta de dos subunidades regulatorias, cada una de las cuales fija dos moles de cAMP, y dos subunidades catalíticas, formando un complejo R4C2. La holoenzima así constituída es inactiva; pero cuando las subunidades regulatorias fijan cAMP, se disocia y las subunidades catalíticas, por separado, son capaces de fosforilar un gran número de proteínas, entre las cuales está la fosforilasa kinasa. No se ha obtenido todavía la estructura completa de la holoenzima, por lo cual veremos cada una de las subunidades por separado.

Vamos a ver las estructuras de la subunidad catalítica, monómero, a la izquierda, y de la subunidad regulatoria, monómero, a la derecha.

En la subunidad catalítica podemos ver la cadena principal (en azul) y un fragmento (res. 5-24) de un péptido inhibitorio natural, PKI, que aparece en rojo. En cuanto a los ligandos, hay un análogo de ATP (adenilil imidofosfato, AMP-PNP) fijado en el sitio del substrato: ; hay asimismo dos iones Mn++: . El péptido inhibitorio cierra el sitio activo de la enzima:

En la subunidad regulatoria aparecen fijadas dos moléculas de cAMP:

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II.4 Adenilato ciclasa

La adenilato ciclasa es asimismo una enzima compleja, integrada en la membrana celular. Su acción catalítica consiste en producir cAMP y PPi a partir de ATP. Se activa gracias a su interacción con una proteína Ga con GTP ligado; la activación de la adenilato ciclasa dura lo que tarda el GTP en hidrolizarse a GDP. Disponemos de un complejo cristalizado constituído por dos dominios de la adenilato ciclasa (C1A y C2A) y la subunidad Ga de una proteína G. En la pantalla izquierda tenemos el complejo adenilato ciclasa++, en el cual podemos distinguir el dominio C1A: , el dominio C2A: , y la subunidad Ga: .

El complejo ha sido cristalizado en presencia de los siguiente ligandos: (a) 3'-desoxiadenosina monofosfato, ocupando el sitio del AMP producto: ; (b) pirofosfato, producto de la reacción: ; (c) forskolin, un potente activador de la adenilato ciclasa: ; y (d) la subunidad Ga está ligada a un análogo de GTP, en el que el fosfato g aparece sustituído por un átomo de azufre: . Hay asimismo (e) dos iones Mg++: , uno de ellos formando complejo con 3'-dAMP y otro con el análogo de GTP en la subunidad Ga.

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II.5 Proteínas G

Son proteínas heterotriméricas que participan ampliamente en procesos de transducción de señales. La fijación de un ligando al receptor de membrana induce el intercambio de GDP por GTP en la subunidad a, que entonces se disocia del complejo y puede activar, por ejemplo, a la adenilato ciclasa, tal como vimos arriba. Esta activación dura el tiempo que el GTP permanezca como tal ligado a Ga. Al tener ésta actividad GTPasa, el GTP termina por hidrolizarse a GDP, momento en el que se separa de la adenilato ciclasa y vuelve a reasociarse con las subunidades b y g. Presentamos aquí la estructura del trímero abg de proteína G .

Las subunidades son las siguientes; Ga: ; Gb y G g: . Todas ellas son en realidad fragmentos de la proteína original.

El complejo ha sido cristalizado con el ligando fisiológico de reposo, GDP: .

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