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Estudio estructural de la aspartato transcarbamilasa

La síntesis de pirimidinas comienza con la unión de carbamilfosfato a aspartato, con liberación de fosfato inorgánico, para dar carbamilaspartato. Se trata del primer paso comprometido en la biosíntesis de pirimidinas, y está catalizado por la enzima Aspartato transcarbamilasa (Carbamil fosfato: L-aspartato carbamil transferasa, EC 2.1.3.2).

Esta enzima tiene un interesantísimo comportamiento regulatorio. Ya desde los estudios de Gerhart y Pardee en los ‘50 se sabe que su actividad se inhibe por el nucleótido CTP, que es uno de los productos finales de la biosíntesis de pirimidinas. De esta forma, la ATCasa es un sistema típico de retroalimentación negativa. Pero al mismo tiempo, la ATCasa es activada por ATP, producto final de la biosíntesis de purinas. De esta forma, síntesis de purinas y pirimidinas quedan reguladas mutuamente. Por otra parte, la enzima muestra una cinética anómala respecto a sus dos substratos, carbamilfosfato y aspartato, dando lugar a una dependencia sigmoide de la velocidad respecto a la concentración de substrato.

La enzima consta de dos tipos de subunidades, catalítica y regulatoria, habiendo dos subunidades catalíticas y tres regulatorias por molécula. Cada subunidad catalítica consta de tres polipéptidos (c3) y la regulatoria de dos (r2), por lo que la enzima completa es un dodecámero (c3)2 (r2)3. Las subunidades catalíticas fijan y transforman a los substratos, mientras que las regulatorias fijan a los efectores (CTP y ATP).

La enzima mejor estudiada es la de Escherichia coli, a partir de trabajos llevados a cabo por W.Lipscomb y colaboradores en la universidad de Harvard. En esta demostración nos basamos sobre todo en estos trabajos; un buen resumen está en Kantrowitz,E.R. y Lipscomb,W.N., Science, 241 (1988), 669-674.

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1. El monómero regulatorio

La subunidad regulatoria de la aspartato transcarbamilasa está formada por dos monómeros idénticos, y hay tres subunidades regulatorias por molécula de holoenzima. En primer lugar, vamos a examinar el monómero regulatorio, estado T en la pantalla izquierda, y en la derecha el monómero regulatorio, estado R. A efectos de recordar la situación, la forma R se carga en la pantalla derecha (inglés Right). Se representan en colores de estructura secundaria.

Los sitios propios de esta subunidad son:

(a). El sitio alostérico está constituído por una lámina b que fija nucleótidos, en el estado T:   y el mismo sitio en la forma R: En este sitio encontramos nucleótidos fijados: CTP, inhibidor alostérico, en la forma T:   y ATP, activador alostérico, en la forma R:

(b). El sitio del zinc, con un átomo de zinc tetracoordinado a los azufres de cuatro cisteínas, en el estado T:   y el mismo sitio en la forma R: . Estos átomos en zinc están coordinados a los átomos de azufre de cuatro cisteínas, dando un complejo tetraédrico, en el estado T: y en el estado R: . Se trata de un complejo parecido al conjunto Fe-S de ferrosulfoproteínas como la rubredoxina.

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2. El monómero catalítico

La subunidad catalítica de la aspartato transcarbamilasa está formada por tres monómeros idénticos, y hay dos subunidades catalíticas por molécula de holoenzima. En primer lugar, vamos a examinar el monómero catalítico, estado T (en la pantalla izquierda, sin ligandos), y en la pantalla derecha el monómero catalítico, estado R, con fosfonoacetamida (PAM) y malonato (MAL) unidos al centro activo. Igual que anteriormente, la forma R se carga en la pantalla derecha (inglés Right) y se representan inicialmente en colores de estructura secundaria.

Podemos visualizar los residuos del centro catalítico en el estado T:   y el mismo sitio en la forma R:

Rotando convenientemente la molécula podemos apreciar cómo el centro activo está "abierto" en la forma T y "cerrado" en la forma R. Es la fijación de los substratos lo que determina este cierre de la molécula. En la subunidad catalítica, cada centro activo está formado por aminoácidos procedentes de dos monómeros contiguos; ésa es la razón por la que los residuos Ser 80 y Lys 84 están separados del núcleo principal del centro.

Los ligandos presentes en el centro activo en la forma R son: (a) Fosfonoacetamida (PAM):   y malonato:

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3. La subunidad regulatoria

La subunidad regulatoria propiamente dicha de la aspartato transcarbamilasa consta de dos monómeros r como el que vimos más arriba. La asociación de da lugar a la subunidad regulatoria, dímero, estado Ten la pantalla izquierda, y en la derecha la subunidad regulatoria, dímero, estado R. Como hicimos anteriormente, la forma R se carga en la pantalla derecha (inglés Right).

En esta representación podemos ver:

(a) la situación relativa de ambos monómeros difieren en los estados R y T. Se puede apreciar que en el estado R el ángulo que forman los ejes mayores de ambos dímeros está más abierto que en la forma T.

(b) El sitio alostérico que fija nucleótidos en el estado T:   y lo mismo en el estado R:

(c) Los nucleótidos fijados, CTP en el estado T:   y ATP (una sola molécula) en el estado R:

(e) El sitio del zinc, en el estado T:   y lo mismo en el estado R: .

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4. La subunidad catalítica

La subunidad catalítica propiamente dicha de la aspartato transcarbamilasa consta de tres monómeros c como el que vimos más arriba. La asociación de los tres da lugar a la subunidad catalítica, trímero, estado T, y en la pantalla derecha la subunidad catalítica, trímero, estado R. Como siempre, la forma R se carga en la pantalla derecha (inglés Right).

Los sitios catalíticos están formados por aminoácidos que pertenecen a monómeros distintos, tal como podemos ver en el estado T:   y lo mismo en el estado R: . Aquí hemos utilizado el colour Chain para apreciar la participación en dicho centro de aminoácidos de otros monómeros.

Aparecen ligandos unidos solamente en el estado R. Por un lado, fosfonoacetamida, análogo de carbamilfosfato: y por otro malonato, análogo de aspartato: . Obérvese cómo los substratos aparecen ocultos bajo los distintos residuos del centro activo, lo cual es una característica del estado R. En el estado T los centros activos permanecen abiertos.

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5. Un análogo de estado de transición: Fosfonoacetil-L-aspartato (PALA)

Gran parte de los estudios sobre la ATCasa se han llevado a cabo mediante el uso del fosfonoacetil-L-aspartato (PALA), análogo de estado de transición de la enzima y que se fija con una enorme afinidad al estado R. Para examinar el concepto de análogo de estado de transición procedemos a la demostración siguiente: Cargamos en la pantalla izquierda un monómero catalítico, estado R, con fosfonoacetil-L-aspartato (PALA) cargado en el centro activo, y en la pantalla derecha otro monómero catalítico, estado R, con fosfonoacetamida (PAM) y malonato (MAL) ocupando asimismo el centro activo.

Por la visión de los centros activos nos damos cuenta que ambas subunidades están en el estado R (ambas tienen "cerrado" el centro activo); por una parte, la que tiene PALA fijado: y por otra la que tiene PAM y MAL: . Podemos ver la fijación de ligandos, PALA en un caso: y PAM y MAL en otro:

Es interesante comprobar la analogía que presenta PALA con el conjunto de los dos substratos. Para ello, restringimos la visión al ligando en la ventana izquierda: y en la ventana derecha: ; podemos representar asimismo los residuos del centro activo, en una pantalla: y en la otra:

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6. Estudio de la molécula completa

La aspartato transcarbamilasa tiene una estructura cuaternaria (c3)2(r2)3, esto es, consta de dos subunidades catalíticas compuestas por tres monómeros cada una, y tres subunidades regulatorias formadas a su vez por dos monómeros cada una. El conjunto es una molécula altamente simétrica, con un eje ternario de simetría y tres ejes binarios perpendiculares al anterior. Vamos a continuación a ver una panorámica de la molécula entera. Cargamos en la pantalla izquierda ATCasa, dodecámero completo, estado T, y en la pantalla derecha ATCasa, dodecámero completo, estado R; como siempre, la forma R se carga en la pantalla derecha (inglés Right).

La visión que se obtiene es a lo largo del eje ternario de simetría. Lo más cercano al observador es una de las dos subunidades catalíticas c3. Podemos verla asimismo a lo largo de uno de los ejes binarios: la forma T, y en la forma R, , con lo que lo más cercano al observador es uno de los tres dímeros regulatorios r2.

Se puede apreciar que la forma R aparece más expandida que la T, dando lugar a un interior hueco, mientras que en la forma T este interior es más compacto.

Vista así, las subunidades catalíticas están en los "polos" de la molécula, en el estado T: y en el estado R: mientras que las subunidades regulatorias ocupan el "ecuador" de la misma; en el estado T: y en el estado R:

Podemos ver los ligandos alostéricos fijados a las distintas subunidades: CTP a la forma T, y ATP a la forma R: Hemos de tener en cuenta que sólo hay un ATP fijado a cada una de las subunidades catalíticas (podría haber dos).

El lugar del substrato sólo está ocupado en el estado R por fosfonoacetamida (PAM) y malonato (MAL), tal como hemos visto en los apartados anteriores de esta demostración. En la representación actual de la molécula (spacefill) sería imposible ver los substratos fijados; para verlos, cambiamos la representación a cartoons: en el estado R.

Podemos ver el interior de la molécula mediante un comando tipo slab; así, en el estado T: y en el estado R: . Puede verse cómo en este último la parte central de la molécula está más hueca que en el estado T.

Para volver a la representación original: Estado T, y en el estado R:

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