http://hdl.handle.net/10366/135795 2026-04-22T16:51:21Z http://hdl.handle.net/10366/153413 La Insuficiencia Ovárica Prematura (POI) implica una alteración en la función ovárica que causa infertilidad femenina. Recientemente se ha identificado una variante de la recombinasa RAD51B con el extremo N-terminal truncado (RAD51B-c.92delT) en dos hermanas afectadas por POI (Franca et al., 2022). Partiendo de estos resultados, se decidió ratificar la letalidad embrionaria asociada a la deficiencia de Rad51b en ratones, así como validar la función de su extremo N-terminal en meiosis. Para ello, se generaron mediante la tecnología de edición genómica CRISPR/Cas9 los mutantes Rad51bSAES5/SAES5 y Rad51bΔExon3/ΔExon3. El análisis de sus meiocitos reveló un fenotipo similar al de los ratones Rad51bc.92delT/c.92delT, con defectos en la reparación del DNA por una acumulación de γH2AX, RAD51 y BRME1 en los ejes cromosómicos y una reducción en el número de entrecruzamientos, que no impidió la generación de espermatozoides. Estos resultados demuestran que la pérdida de integridad del dominio N-terminal de RAD51B, pese a no causar infertilidad, afecta a la recombinación meiótica y cuestiona si la función de RAD51B es indispensable para el desarrolloembrionario en el ratón. 2023-06-30T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/150832 La leucemia mieloide crónica es una neoplasia mieloproliferativa que se caracteriza por la formación del oncogén de fusión BCR/ABL en las células madre hematopoyéticas como consecuencia de la traslocación recíproca t(9;22)(q34;11.2). Su expresión origina la oncoproteína BCR/ABL que presenta actividad tirosina quinasa constitutiva, lo que provoca la expansión clonal de dichas células madre e infiltrados extramedulares. Actualmente, el principal tratamiento disponible son los fármacos inhibidores de la actividad tirosina quinasa, que ofrecen una esperanza de vida normal cuando son administrados de forma crónica. Sin embargo, esto provoca la aparición de resistencias y recaídas en el paciente al no revertirse la causa genética de la enfermedad. Ante este escenario, las terapias génicas basadas en técnicas de edición genética como el sistema CRISPR/Cas9 representan una prometedora herramienta para el tratamiento molecular de este tipo de patologías. Sin embargo, el uso de esta tecnología muestra limitaciones, como su baja eficiencia y la dificultad de seleccionar las células editadas. Como solución, en este trabajo se plantea una nueva aproximación terapéutica basada en la estrategia CRISPR-Trap que permita simultáneamente la eliminación in vitro de la expresión de BCR/ABL y la selección de las células correctamente editadas al combinar el sistema CRISPR/Cas9 junto con la tecnología de trampa génica. 2022-06-30T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/150831 El desarrollo de la bioinformática y la metagenómica ha facilitado el trabajo de los investigadores en el análisis del material genético de muestras procedentes directamente del medioambiente. Para llevar a cabo esta labor, las técnicas de secuenciación de alto rendimiento y la metagenómica de amplicones basada en el gen del ARNr 16S cumplen un papel esencial. En este estudio, se ha analizado el microbioma de la piel de tres individuos sanos (A, B y C) mediante la utilización de varias herramientas bioinformáticas con funciones que comprenden tanto el preprocesamiento y la asignación taxonómica de las secuencias genéticas como el análisis estadístico de la diversidad. Una vez evaluada la calidad de los datos utilizados, se ha considerado que los clasificadores de aprendizaje automático Kraken 2 y QIIME 2 feature classifier junto con la base de datos Greengenes son las combinaciones más eficaces entre las utilizadas en este trabajo. Se han observado diferencias significativas en cuanto a la diversidad alfa y beta, siendo el microbioma del individuo B el más diverso y con una representación menor de microorganismos del género Propionibacterium. Estos resultados son coherentes en comparación con los resultados obtenidos en el artículo de referencia. 2022-03-04T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/147492 La leucemia mieloblástica aguda constituye una neoplasia hematológica derivada de la acumulación de elementos celulares indiferenciados infiltrados en sangre, médula ósea y otros tejidos representando el tipo más común en adultos. La vigilancia inmunitaria antitumoral por parte del sistema inmunitario permite prevenir la aparición de cáncer a través de elementos celulares tales como células NK y linfocitos T, mediante receptores KIR y HLA, respectivamente. Se estudiaron los genes KIR y HLA de 312 pacientes y 1164 voluntarios sanos de la región de Castilla y León (España) mediante tecnología Luminex®, basada en reacción en cadena de polimerasa con oligonucleótidos específicos de secuencia; y secuenciación masiva o NGS. Se obtuvieron las frecuencias de los genes HLA y KIR en la población estudiada, siendo HLA-A*02:01, HLA-B*44:03, HLA-C*04:01, HLA-DRB1*07:01, HLA-DQB1*03:01, KIR3DL3 y KIR3DP1 los más frecuentes tanto en pacientes como controles. Los alelos HLA-C*12:02, HLA-DRB1*14:01, HLA-DQB1*06:01 y KIR2DS4 se asociaron con desarrollo de LMA. Pacientes HLA-B*53:01 positivos y >65 años presentaron menor supervivencia global. Los genes significativamente asociados al desarrollo de LMA, constituyen mayoritariamente el haplotipo A*02:01~B*52:01~C*12:02~DRB1*15:02~DQB1*06:01, lo cual puede resultar de gran relevancia clínica. 2021-07-16T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/147490 El fitomejoramiento es una actividad que se ha llevado a cabo desde el inicio de la agricultura. Tradicionalmente, las variedades mejoradas se obtenían a partir de métodos de cruzamiento selectivo y los obtentores se veían remunerados gracias a la protección del producto bajo el Derecho de Obtención Vegetal. Con el desarrollo de la ingeniería genética algunos investigadores consideraron que este sistema era insuficiente y empezaron a buscar protección bajo el Derecho de Patentes, sistema que ha tenido que adaptarse a las invenciones que comprenden materia viva. El establecimiento de los límites entre los dos tipos de regulación no ha estado exento de polémica y la Oficina Europea de Patentes ha tenido que hacer un gran esfuerzo en la interpretación de las normativas para determinar la forma de protección jurídica más apropiada en cada caso. En la actualidad, los avances biotecnológicos, como la edición genética, han puesto de manifiesto la necesidad de tener una legislación adecuada tanto en materia de regulación como de protección de la innovación vegetal. En lo referente a la Unión Europea, la posición restrictiva que mantiene sitúa al sector agroalimentario europeo en desventaja competitiva frente a otras potencias mundiales. 2021-07-16T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/147489 Las células están expuestas a agentes genotóxicos que pueden afectar a la integridad genética. Para evitarlo, han desarrollado una compleja ruta de señalización conocida como “respuesta a daño en el ADN”, en la que las proteínas quinasas ocupan un papel relevante dada su importancia en la fosforilación y activación de los componentes de la misma. Sin embargo, dada la necesidad de una fina regulación de esta ruta, las proteínas fosfatasas están adquiriendo una mayor relevancia. En este trabajo se ha evaluado el papel de la fosfatasa Cdc14 en la respuesta a una rotura de doble cadena, así como la propia regulación de su localización y actividad. Los resultados demuestran que la localización subcelular núcleo/citoplasma de Cdc14 está controlada por las regiones NLS (Nuclear Localization Signal) y NES (Nuclear Export Signal) de la proteína, siendo necesaria una modificación postraduccional por SUMOilación para el reconocimiento de esta última. Curiosamente, una acumulación permanente de Cdc14 en el nucleoplasma disminuye la actividad Cdk celular, hecho que afecta al proceso de reparación. Estos datos indican que la regulación espacial de Cdc14 es fundamental para la correcta reparación de roturas en el ADN; y por tanto, para la correcta viabilidad celular en respuesta a estrés genotóxico. 2021-07-16T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/147488 El reactivo Brilliant Stain Buffer (BSB), diseñado para reducir artefactos en ensayos de citometría de flujo (CMF), causados por interacciones entre fluorocromos conjugados a anticuerpos monoclonales, podría conferir mayor estabilidad a los fluorocromos, y facilitar la preparación técnica e interpretación de resultados. Objetivos: Evaluar la estabilidad de los cócteles de anticuerpos preparados con antelación, para el análisis de poblaciones leucocitarias en sangre periférica (SP) por CMF y el beneficio potencial del BSB para preservar el cóctel en el tiempo. Métodos: Se procesaron muestras de SP por CMF utilizando dos paneles (TCD4 y TCD8) con y sin BSB, utilizando los cócteles preparados el día de su uso, 24h y 5 días antes de su uso. La estabilidad de los anticuerpos se comparó mediante el Stain Index (SI). Resultados: Se observó cierta variabilidad en la estabilidad de algunos fluorocromos con el paso del tiempo, principalmente en el panel TCD8, aunque el SI no varió sustancialmente (vs control sin BSB). En general, no había diferencias entre los tubos con y sin BSB. Conclusiones: La antigüedad del cóctel pre-preparado de anticuerpos no perjudica la estabilidad del cóctel y el uso de BSB no parece afectar de forma negativa a la estabilidad del cóctel. 2021-07-18T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/147485 En la isquemia cerebral, la interacción entre los radicales libres de oxígeno (ROS), la acumulación de roturas de doble hebra en el DNA (DSBs) y su implicación en la apoptosis neuronal se desconoce. El objetivo fue estudiar el impacto de las DSBs en la muerte neuronal isquémica y el papel del estrés oxidativo en su formación. Utilizamos cultivos neuronales murinos wild type y con expresión constitutiva de la catalasa en la mitocondria (mCAT) para controlar los niveles endógenos de ROS, que fueron sometidos a isquemia (incubación en ausencia de oxígeno y glucosa) y 4 horas de reoxigenación. Analizando la expresión proteica y la apoptosis neuronal mediante western blot, inmunofluorescencia y citometría de flujo, comprobamos que la isquemia provoca, de manera dependiente del tiempo, la formación de DSBs (incremento de γH2AX) y la generación de ROS por la mitocondria. Ello culmina en la apoptosis, detectada por los marcadores p53, caspasa-3 activa y AnexinaV+/7AAD-. Las neuronas mCAT presentan una menor acumulación de DSBs y apoptosis respecto a las wild type, Nuestros resultados muestran la importancia del estrés oxidativo en la formación de DSBs involucrada en la apoptosis neuronal causada por isquemia y la terapia antioxidante como posible estrategia neuroprotectora frente el ictus. 2021-07-16T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/147483 El asma es una enfermedad respiratoria crónica caracterizada por la inflamación de las vías respiratorias. La evaluación clínica y fisiopatológicadel asma grave a menudo es insuficiente para predecir la respuesta a los tratamientos. Con la irrupción de la medicina personalizada de precisión y la aparición de nuevas terapias dirigidas, se ha hecho evidente la necesidad de definir biomarcadores reproducibles y sencillos de cuantificar. Actualmente solo hay unos pocos disponibles para uso clínico. Estos biomarcadores junto con las manifestaciones clínicas del paciente, desempeñan un papel importante en la identificación de fenotipos y endotipos, para identificar el diagnóstico, y predecir el curso clínico y pronóstico y mejorando el abordaje terapéutico de precisión del asma. El objetivo de este trabajo es agrupar la información obtenida a través de los diferentes estudios realizados hasta el momento, para la identificación de biomarcadores predictivos que nos permitan definir que fármaco biológico se ha de prescribir a cada paciente para conseguir la mejor respuesta y de esta manera evitar tratamientos innecesarios, dado el elevado coste que supone la aplicación y el seguimiento de estos. 2021-07-16T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/144043 La bacterioferritina Bfr, codificada por el gen SCO2113 de Streptomyces coelicolor, está implicada en la producción de antibióticos por este organismo[1]. En este trabajo, se ha estudiado el efecto que la sobreexpresión de este gen ejerce sobre la diferenciación morfológica y sobre la producción de los antibióticos actinorrodina y undecilprodigiosina. Se ha valorado la respuesta del promotor de este gen a hierro y se ha estudiado su expresión en Escherichia coli bajo el control del promotor T7. Por otro lado, también se ha estudiado la respuesta al estrés oxidativo del mutante delecionado en el gen correspondiente (Δbfr). Los resultados han mostrado una reducción en la síntesis de los antibióticos estudiados en condiciones de sobreexpresión del gen y se ha comprobado que el promotor de la bacterioferritina no responde directamente a la concentración de hierro. La expresión del gen bfr en E. coli nos permitió purificar gran cantidad de esta proteína y observar que forma agregados al mantenerse a 4 ºC durante al menos 2 días. Por último, el ensayo de estrés oxidativo ha revelado una mayor sensibilidad del mutante Δbfr al peróxido de hidrógeno. 2020-06-30T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/140189 The house mouse (Mus musculus) has become the main animal model used in biomedical research, because of its physiological and genetical similarity with the human being. Over the last years, the development of the genomic editing tools has led to the generation of genetically modified (GM) mice, entailing great progress in research work. Within these tools, the discovery and improvement of the CRISPR/Cas9 system has been particularly revolutionary due to its design´s simplicity, efficiency and versatility. Originally described as an adaptive immunity mechanism in bacteria and archaea, it is composed of two elements: the single-read ribonucleic acid (sgRNA) or RNA guide and the endonuclease Cas9. The first one is made up of a 20 nucleotides sequence called CRISPR ribonucleic acid (crRNA), which defines the system’s specificity and is linked to a structural sequence named trans-activating crRNA (tracrRNA). When this hybridizes with the target sequences, the nuclease produces a double-strand break (DSB), activating endogenous mechanisms of DNA repair. This involves the gene disruption, leading to knock-out models; or the insertion of homologous molecules, producing knock-in models. The current strategy to produce GM mice is based on the microinjection of the CRISPR/Cas9 system components into one of the zygote’s pronuclei and its subsequent transfer to a female´s oviduct. The pronuclear microinjection is a quite slow process that requires expensive and sophisticated equipment and experienced personnel. As an alternative, we propose the use of electroporation to introduce the CRISPR/Cas9 system reagents in embryos and overcome the raised limitations. Thus, we have checked that the application of high voltage short electrical pulses allows the preservation of zygote’s viability. In addition, these create transient cell membrane pores which sgRNA and Cas9 protein access across. Through the in vitro genotyping process it has been confirmed that these are capable of performing genomic editing on specific locus. Finally, a specific sgRNA against tyrosinase gene (Tyr), involved in the mouse´s coat color, was designed. Therefore, the generation of albino and/or mosaic mice has allowed us to easily determine the editing and knock-out alleles’ generation efficiency with both techniques. It has been concluded that electroporation is a method as effective as pronuclear microinjection, so it could become its real substitute. 2019-07-19T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/140188 The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized cells that constitutes a barrier between photoreceptor cells of the neural retina and the choroidal blood capillaries, the so-called blood-retinal barrier. These cells play a critical role in the maintenance of retinal homeostasis and visual function. Therefore, damage in this cellular layer may cause several pathologies such as age-related macular degeneration (AMD). In AMD, the damage in the RPE cells leads to photoreceptor degeneration, causing a partial or total vision loss. The molecular mechanisms involved in the early stages of the disease are still unknown, but the available studies suggest that RPE cells may undergo an epithelial-mesenchymal transition triggered by the pathological environment; thus, promoting the progression of the disease. To test this hypothesis, in the present study we have performed a protein analysis of human retinal pigment epithelial cell cultures, treated with serum from patients with AMD. The protein markers used in the analysis were first tested, classified and selected by using them to characterize the developmental process of the epithelial cell culture at 7, 14 and 21 days. The results achieved in this study are consistent with the suggested phenotypic change, but they should be considered as preliminary data that must be complemented with additional experiments. 2019-08-12T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/135824 [ES]Más de 2000 millones de personas están utilizando fuentes de agua contaminadas, lo que se relaciona directamente con el crecimiento de enfermedades infecciosas y el envenenamiento a través del consumo de sustancias químicas nocivas. Muchas consecuencias se pueden ver como resultado de esto, incluida una menor calidad de vida y un aumento en el costo de la atención médica. Los factores antes mencionados afectan en gran medida el desarrollo de estas sociedades. Este proyecto implementa la introducción de filtros de bioarena en la comuna Nikki, al norte de Benin. Los filtros se producen con materiales locales, lo que permite un fácil acceso a los recursos necesarios y la rentabilidad, y ofrece excelentes resultados para la regeneración de agua contaminada. El objetivo de esta investigación ha sido caracterizar la capacidad de eliminación de ciertos patógenos mediante este método. Los patógenos estudiados están relacionados con las enfermedades infecciosas más peligrosas y prevalentes transmitidas a través de la ingestión de agua contaminada diseminada por todo el país. Los agentes contaminantes seleccionados fueron bacterias fecales, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, así como varias especies de helmintos parásitos y diversos materiales químicos inorgánicos. Durante estos estudios de laboratorio, se encontraron reducciones promedio del 95-100% de algunos de estos contaminantes, lo que permite la deducción del potencial de purificación del sistema propuesto. Además, serán necesarios nuevos estudios para determinar la capacidad de extracción de productos químicos inorgánicos disueltos en agua. 2017-06-30T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/131526 [ES]Las cestodosis son enfermedades parasitarias producidas por helmintos de la clase Cestoda (Phylum Platyhelminthes). Esta clase agrupa a gusanos acintados, endoparásitos obligados de mamíferos, incluyendo al hombre. Teniendo en cuenta que durante la enfermedad el ser humano puede comportarse como hospedador definitivo o intermediario de estos parásitos, las cestodosis se clasifican en dos grupos: las producidas por gusanos adultos, en las que los humanos se comportan como hospedadores definitivos y albergan al parásito en su aparato digestivo; y las producidas por fases larvarias, en las que los humanos son hospedadores intermediaros y albergan fases quísticas en los tejidos. El presente trabajo se centra en las teniasis o teniosis, enfermedades parasitarias intestinales causadas por las formas adultas de los cestodos del género Taenia (las comúnmente denominadas tenias), y también por las formas larvarias, de mayor gravedad clínica, que causan cisticercosis y cenurosis (Hoberg, 2002). La clasificación del género Taenia se realiza en función de sus características larvarias, ya que en estadios adultos son muy similares morfológicamente. Existen 40 especies descritas, y 4 subespecies (Hoberg, 2002). Tres especies tienen como hospedador definitivo al hombre: T. solium, T. saginata y T. asiatica. Otras especies como T. multiceps, T. serialis o T. taeniaeformis también pueden producir excepcionalmente infecciones humanas al entrar el hombre en contacto con animales infectados. Hasta la fecha no se han descrito infecciones por T. hydatigena en seres humanos, pero su estudio tiene interés en clínica veterinaria ya que pueden aparecer coinfecciones con T. solium en el ganado porcino, dificultando el diagnóstico serológico al producir reacciones cruzadas entre ambas y causando importantes pérdidas económicas al tener que descartar la carne para el consumo humano. 2016-10-31T00:00:00Z