http://hdl.handle.net/10366/143112 2026-04-28T17:53:47Z http://hdl.handle.net/10366/170349 [ES] La meiosis es un proceso clave en organismos con reproducción sexual, donde la correcta segregación cromosómica depende de eventos como la sinapsis y la recombinación entre homólogos. En respuesta a defectos en estos procesos, se activa el checkpoint de recombinación meiótica, que retrasa la progresión meiótica mientras los defectos persistan, con el fin de preservar la integridad genética de los gametos. En Saccharomyces cerevisiae, el mutante zip1, que carece del complejo sinaptonémico, activa este checkpoint y bloquea la meiosis. Esta tesis demuestra que la sobreproducción de la polo-quinasa Cdc5 suprime parcialmente dicho bloqueo, induciendo la expresión prematura de Ndt80, un factor clave para la progresión meiótica. Se ha detectado una interacción física entre Cdc5 y Ndt80, y que Ndt80 contiene un motivo consenso de unión a las cajas polo, cuya mutación ralentiza la progresión de la meiosis. En conjunto, nuestros resultados sugieren un mecanismo de retroalimentación adicional en la regulación del ciclo celular meiótico en el que Cdc5 activa a Ndt80 para promover la salida de profase I. Además, se ha determinado que la región N-terminal de Cdc5, que contiene motivos de reconocimiento por el complejo Anafase-Promoting Complex/Cyclosome (APC/C), es necesaria para esta función reguladora, aunque su papel parece independiente de dichos motivos de degradación. Esto sugiere que esta región podría estar implicada en el reconocimiento específico de sustratos relacionados con la desactivación del checkpoint y/o la disolución del complejo sinaptonémico. Por tanto, se propone que el extremo N-terminal de Cdc5 podría actuar como una plataforma de interacción o reclutamiento que facilita la acción de la quinasa sobre componentes clave del control meiótico. Por otro lado, se ha descubierto y caracterizado una nueva localización y función meiótica de Cdc5 relacionada con la dinámica de los telómeros y el complejo LINC. Cdc5 se detecta en los extremos de los cromosomas y en la envoltura nuclear (NE), colocalizando con Mps3, una proteína SUN del complejo LINC. Esta localización depende de la región N-terminal de Mps3. Se ha demostrado además una interacción física entre ambas proteínas, y que la actividad de Cdc5 regula la distribución de Mps3 en la NE. En ausencia de Cdc5 activo (mutantes ndt80 o inhibición de su actividad quinasa), Mps3 se acumula en regiones discretas de la NE que también contienen la proteína telomérica Rap1, por lo que posiblemente representan agrupaciones de telómeros. La expresión forzada de CDC5 provoca la resolución de estas agrupaciones, la relocalización de Mps3 a lo largo de la NE y la redistribución de Rap1 hacia el interior del núcleo. Estos hallazgos sugieren que Cdc5 promueve la liberación de los telómeros de la NE al final de la profase I, facilitando la transición hacia la primera división meiótica. En conjunto, la tesis propone nuevas funciones meióticas de Cdc5 tanto en la regulación del checkpoint de recombinación como en el control de la dinámica telomérica a través del complejo LINC. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/170307 [ES] La pared celular es una estructura externa a la membrana plasmática que poseen todos los hongos. Está compuesta principalmente por polisacáridos y glicoproteínas y es esencial para mantener la forma y la integridad celular. Por otro lado, para que las células fúngicas se dividan es necesario que se forme un septo transversal de pared celular, que consiste en una estructura trilaminar formada por una capa de septo primario flanqueado por dos capas de septo secundario. En esta tesis utilizamos la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe como modelo de estudio de la pared celular y el septo de división, los cuales están compuestos mayoritariamente por ¿- y ß-glucanos. El ß(1,3)glucano es el polisacárido estructural mayoritario de la pared celular, el cual es sintetizado por el complejo de la ß(1,3)glucán sintasa, que está muy conservado en todos los hongos. Este complejo está compuesto por una subunidad reguladora, la GTPasa Rho1 y una subunidad catalítica, formada por las proteínas esenciales Bgs1, Bgs2, Bgs3 y Bgs4. Bgs2 intervine durante el proceso de diferenciación sexual, mientras que Bgs1, Bgs3 y Bgs4 son esenciales durante el crecimiento vegetativo. Bgs1 es responsable de la síntesis de ß(1,3)glucano lineal del septo primario, que se tiñe específicamente con el fluorocromo calcofluor white. Bgs4 sintetiza el ß(1,3)glucano ramificado que es responsable del septo secundario y es el glucano mayoritario de la pared celular. Ags1 sintetiza el ¿-glucano, también esencial para el septo secundario y la integridad celular. Sin embargo, el papel de Bgs3 es desconocido. Se ha descrito que Bgs3 es esencial durante el crecimiento vegetativo y la germinación, y como el resto de glucán sintasas, se localiza en los polos de crecimiento y en el septo y que en su ausencia se producen acúmulos de pared y células ovaladas. En esta tesis hemos profundizado en el papel de Bgs3 en la formación de la pared celular, en la septación, en la citocinesis y en la polaridad celular. Nuestros resultados indican una cooperación entre Bgs3 y Bgs1 en la síntesis del ß(1,3)glucano lineal y el septo primario ya que la ausencia de Bgs3 da lugar a una acumulación de septos completos sin tinción con CW en su zona central, y la ausencia conjunta de Bgs3 y Bgs1 causa una disminución aún mayor de la tinción con CW, así como la desaparición del septo primario al observar las células mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Durante el crecimiento por los polos, la depleción de Bgs3 bloquea el crecimiento normal de la célula debido a la síntesis aberrante de material de pared celular que no se incorpora adecuadamente a la pared celular, en un proceso dependiente de la función de Bgs4. Además, nuestro resultados también indican que Bgs3 está implicada en el proceso de polaridad celular mediante la colaboración con el complejo Tea1-Tea4 en la regulación de la localización polarizada de los parches de actina y los dominios ricos en esteroles. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/170183 [ES La actina es una de las proteínas más abundantes y mejor conservadas en los organismos eucariotas. Presenta bajo peso molecular y es capaz polimerizar dando lugar a filamentos polarizados, que se asocian con una gran variedad de proteínas constituyendo un citoesqueleto dinámico, que desempeña funciones celulares importantes. En metazoos, las GTPasas de la familia Rho actúan como reguladores esenciales del citoesqueleto de actina y de las 22 GTPasas de esta familia, Cdc42 y RhoA han sido las más estudiadas. Cdc42, a través de las forminas, regula la formación de filopodios, que son protuberancias de la membrana formadas por haces paralelos de actina que permiten a la célula detectar el entorno extracelular. Por su parte, RhoA, junto con la Rho quinasa ROCK y la formina mDia1, da lugar a fibras de estrés, constituidas por filamentos de actina/miosina e implicadas en la generación de fuerzas de tracción y en la maduración de las adhesiones focales. Sin embargo, RhoA desempeña su función más importante en la citocinesis. A través de mDia1, RhoA ensambla los filamentos de actina del anillo contráctil de actomiosina (CAR) y, a través de ROCK y Citrón quinasa, esta GTPasa activa a la miosina II, que se une a los filamentos de actina e impulsa la constricción del CAR. La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe constituye un modelo ideal para el estudio del citoesqueleto de actina, ya que posee un citoesqueleto de actina similar al de metazoos, pero más simple, constituido por tres estructuras de actina (parches, cables interfásicos y CAR) y un número reducido de proteínas asociadas (ABPs). Los parches son estructuras de actina ramificadas nucleados por el complejo Arp2/3, que participan en la endocitosis mediada por clatrina. Los cables interfásicos están formados por filamentos de actina no ramificados. Son nucleados por la formina For3 y participan en la exocitosis polarizada. El CAR está constituido por filamentos de actina no ramificados ensamblados por las forminas Cdc12 y For3 y por la miosina II, y participa en la citocinesis. En S. pombe, las GTPasas de la familia Rho también desempeñan un papel importante en la dinámica del citoesqueleto de actina. La formina For3 es el principal efector de la GTPasa Cdc42 en el ensamblaje de los cables de actina interfásicos. Sin embargo, el papel de Rho1 en el control del citoesqueleto de actina aún se desconoce. Hasta el momento, solo se sabe que la depleción de Rho1 induce la pérdida de estructuras de actina y lisis celular, generalmente en el momento de la citocinesis, y que su sobreproducción da lugar a la despolarización de las estructuras de actina. A lo largo de esta Tesis Doctoral se ha estudiado el papel de Rho1 en el citoesqueleto de actina de S. pombe. Como Rho1 es una proteína esencial, se ha construido un mutante puntual al que hemos denominado rho1-597 y en él se ha caracterizado el citoesqueleto de actina. Además, se ha realizado un cribado genético entre el mutante rho1-597 y numerosos mutantes que codifican las diferentes proteínas implicadas en la dinámica del citoesqueleto de actina. Los resultados obtenidos, junto con el análisis de la localización y la dinámica de diversas proteínas, han sugerido que Rho1 podría regular el citoesqueleto de actina a diferentes niveles. Rho1 podría regular la endocitosis mediada por clatrina (CME) al favorecer la unión de Fim1 a los parches de actina. Rho1 también podría contribuir a la estabilidad de los cables de actina interfásicos, a través de la regulación positiva de Cdc8, y tener un papel en la citocinesis, a través de la formina For3. Además, se ha comprobado que estas funciones de Rho1 en el control del citoesqueleto de actina podrían ser independientes de las que realizan los efectores conocidos de esta GTPasa, las proteínas quinasas C Pck1 y Pck2 y la (1-3) glucán sintasa Bgs1. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/170001 [ES] La enfermedad de Huntington (EH) es un trastorno neurodegenerativo que concurre con la acumulación de la proteína huntingtina mutante (mtHTT) en el cerebro. Aunque tradicionalmente se ha asociado con la pérdida progresiva de neuronas principalmente del estriado y en menor proporción en la corteza, evidencias recientes sugieren que los astrocitos también desempeñan un papel crucial en la etiogénesis y evolución de la enfermedad. En la EH, la disfunción del proceso autofágico contribuye a la acumulación de agregados de mtHTT, aunque aún se debate si los astrocitos participan activamente en esta alteración. La regulación de la autofagia, mediada por el sistema cannabinoide, emerge así como un mecanismo clave para comprender el progreso de la EH. Sin embargo, los efectos de los cannabinoides en esta enfermedad son controvertidos y parecen depender del tipo celular involucrado. En esta tesis doctoral, empleamos un enfoque genético mediado por partículas virales, para inducir de manera selectiva la expresión de HTT en astrocitos. El análisis de la proteostasis de agregación de HTT astrocítica in vitro, demostró que la activación cannabinoide por Δ9- tetrahidrocannabinol (THC) induce un proceso autofágico selectivo. Este medió de forma eficiente la disminución de agregados de mtHTT, así como la preservación de la función mitocondrial, mediada por mitofagia. In vivo, la expresión de mtHTT astrocítica reprodujo características clave de la EH, como gliosis, neurodegeneración y deterioro motor, que fueron prevenidas por THC. Nuestros hallazgos desafían la visión exclusivamente neurocéntrica de la EH y demuestran la relevancia patológica de la agregación de mtHTT astrocítica. El manejo de esta por el sistema cannabinoide resalta el potencial terapéutico de intervenir sobre la función astrocítica en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/167323 [ES] La coordinación del estado metabólico en células neurales se establece a través de dinámicas de comunicación intercelular, donde la señalización mitocondrial emerge como un eje regulatorio fundamental. Así, la transferencia intercelular de estos orgánulos ha demostrado ser un evento fisio(pato)lógico en células neurales, con una especial relevancia en el Sistema Nervioso. Pese a los creciente avances en la caracterización estructural y funcional de la transferencia mitocondrial, su impacto sobre el remodelado metabólico en células receptoras y su correlato fisiológico en el mantenimiento metabólico del cerebro permanecen en gran parte inexplorados. Para abordar esta brecha de conocimiento, implementamos un modelo experimental in vitro que combina técnicas de trazado mitocondrial fluorescente con análisis metabólicos de alta eficiencia. Este diseño permitió estudiar la capacidad de transferencia mitocondrial entre células neurales y evaluar las consecuencias metabólicas de la adquisición de mitocondrias exógenas en astrocitos. Mediante dos enfoques - la interacción directa con neuronas primarias en co-cultivo, o la administración de mitocondrias aisladas de origen neural-, caracterizamos los posibles mecanismos de reconfiguración metabólica asociados a la internalización mitocondrial y, por ende, la función fisiológica de la transferencia mitocondrial. Los resultados obtenidos demuestran que la adquisición de mitocondrias neuronales por astrocitos induce un remodelado de la red mitocondrial y su morfología en las células receptoras. A nivel funcional, este proceso desencadena una reprogramación metabólica astrocítica mediada por mecanismos de señalización. Esta reconfiguración se manifiesta principalmente en un aumento de la β-oxidación de ácidos grasos, acompañado de una estimulación de la cetogénesis y una activación astrocitaria hacia un fenotipo reactivo. Estos cambios se traducen en un aumento de liberación de cuerpos cetónicos al medio extracelular, y previsiblemente otros factores, que pueden ser captados por las neuronas para mejorar su respiración mitocondrial. Creemos que estos hallazgos aportan una valiosa información sobre cómo la transferencia mitocondrial opera como un sistema de señalización intercelular, que orquesta la cooperación metabólica astrocito-neurona. La internalización de mitocondrias neuronales por astrocitos activa rutas catabólicas generadoras de sustratos energéticos (cuerpos cetónicos) que son transferidos de vuelta a las neuronas, estableciendo un circuito de retroalimentación positiva. Las implicaciones de este estudio trascienden al ámbito básico, revelando que la plasticidad fenotípica de los astrocitos, tanto en su estado funcional como metabólico, puede ser modulado por señales mitocondriales exógenas. Esto abre perspectivas hasta ahora inexploradas en neurobiología y enfoques terapéuticos relacionados. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/167291 [ES] Los promotores eucariotas presentan una organización característica, en la que dos nucleosomas (+1 y -1) flanquean una región libre de nucleosomas (NDR). Esta disposición facilita el acceso del DNA a los factores de transcripción (TFs) y juega un papel fundamental en la regulación del inicio de la transcripción. Las NDRs situadas en el extremo 5' de los genes contienen información esencial para la regulación génica. A partir de esta observación, empleamos herramientas bioinformáticas para identificar motivos de secuencia sobrerrepresentados en las NDRs de Schizosaccharomyces pombe. Este análisis reveló 72 motivos significativamente sobrerrepresentados en promotores de esta especie, incluyendo 17 de los 20 motivos previamente descritos. Además, varios de estos motivos muestran una posición definida respecto al sitio de inicio de la transcripción (TSS), una característica conservada en Schizosaccharomyces octosporus, lo que refuerza su posible relevancia funcional. Para profundizar en el papel funcional de los motivos identificados, esta tesis doctoral se centra en analizar su distribución y contribución a la regulación transcripcional, utilizando como modelo los genes que codifican proteínas ribosómicas (RPG), cuya expresión está finamente regulada y conservada en eucariotas. En S. pombe, estos promotores contienen motivos bien caracterizados, como Homol D y Homol E, localizados en posiciones específicas dentro de la NDR, lo que los convierte en un sistema ideal para estudiar la relación entre la arquitectura del promotor y la determinación del sitio de inicio de la transcripción. Nuestros análisis funcionales mostraron que la NDR, coincidente con la región 5 de los genes, contiene información suficiente y portátil para iniciar la transcripción. Sin embargo, ni el aumento en su tamaño ni la modificación de los motivos de unión de TFs afectan la localización del sitio de inicio, lo que sugiere que los TFs influyen principalmente en la eficiencia de transcripción, pero no en la selección precisa del TSS. Profundizando en la arquitectura del promotor, identificamos al nucleosoma +1 como un componente estructural clave: su posición contribuye en determinar la localización del TSS dentro de una ventana óptima de aproximadamente 20 nucleótidos desde su extremo más próximo al NDR. Complementariamente, observamos que la secuencia de DNA en la región de inicio presenta un patrón de composición nucleotídica no aleatorio, lo que apunta a un posible papel de la secuencia en la selección del TSS. En conjunto, estos resultados subrayan que la localización precisa del sitio de inicio de la transcripción no depende de factores de transcripción, sino que sugieren una posible influencia de la arquitectura del promotor y de la secuencia del DNA. Esta visión integrada aporta nuevas claves para entender cómo se determina el inicio de la transcripción en eucariotas. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/167177 [EN] In Schizosaccharomyces pombe, quiescence is triggered by nitrogen starvation. Under these conditions, proliferating cells undergo two consecutive divisions without growth and arrest in G1 phase, ultimately entering a quiescent G0 state. The conserved Greatwall-Endosulfine-PP2A/B55 (GEP) pathway acts as a key molecular sensor, transducing the nitrogen starvation signal to the cell cycle machinery and accelerating the final divisions required for quiescence entry. Upon TORC1 inactivation, the Greatwall-Endosulfine switch becomes active, leading to the inhibition of the PP2A/B55 phosphatase. This facilitates phosphorylation of Cdk1/Cyclin B targets for mitotic entry and activation of TORC2 targets, such as the AKT orthologue Gad8, promoting mitosis, quiescence, differentiation and mating. Nitrogen starvation also triggers a switch between TORC1 and TORC2 activity. Elongatordependent tRNA modifications are essential for this nutrient-driven switch by promoting the efficient translation of AAA codon-enriched mRNAs, including those encoding TORC2 activators (tor1, ste20, gad8) and TORC1 inhibitors (tsc1, tsc2, npr2, npr3). Simultaneously, TORC2 enhances Elongator activity by inhibiting Gsk3 through Gad8-mediated phosphorylation of Elp4 at serine 114. This establishes a positive feedback loop between TORC2 and Elongator, reinforcing the TORC1-to- TORC2 transition. Recently it has been demonstrated that the GEP pathway regulates the switch from TORC1 to TORC2 during entry into quiescence by enhancing Elongator-dependent tRNA modifications at the anticodon stem-loop, increasing the translation efficiency and fidelity of mRNAs enriched for AAA versus AAG lysine codons. Under nitrogen starvation, activation of the GEP pathway allows proper inhibition of PP2A/B55, which is critical for the accumulation of phosphorylated Gad8 and full activation of TORC2. TORC2 then promotes the activity of Elongator, establishing the positive feedback loop between TORC2 and Elongator. In cells lacking Endosulfine, this regulatory cascade is disrupted: PP2A/B55 remains active, Gad8 phosphorylation is reduced, and Elongator function is impaired. Consequently, levels of critical tRNA modifications decline, leading to inefficient translation of specific transcripts involved in TOR signalling and nuclear architecture. These modifications enhance translation of mRNAs essential for telomere-anchoring at the nuclear envelope and subtelomeric gene silencing. In addition to subtelomeric derepression, Greatwall and Endosulfine mutants display upregulation of Tf2 retrotransposon genes during nitrogen starvation. Transposable elements constitute a significant portion of eukaryotic genomes, with retrotransposons representing a major subclass capable of transcribing and integrating into the host genome. The insertion of retrotransposon-derived cDNA is inherently mutagenic and poses a threat to genome integrity. As a result, retrotransposon activity must be tightly controlled throughout the organism's life cycle to preserve genomic stability. In this doctoral thesis, the role of the Greatwall-Endosulfine-PP2A/B55 pathway in the silencing Tf2 retrotransposons during entry into quiescence in Schizosaccharomyces pombe has been investigated. Specifically, this work: (1) analyses the effect of Endosulfine loss on Tf2 expression, particle formation, and mobilization under nitrogen starvation; (2) determines how lysine AAA codon bias influences the translation of proteins involved in Tf2 regulation; and (3) assesses whether the absence of Endosulfine results in increased Tf2 insertions and to evaluate the potential adaptive or deleterious consequences of these events during quiescence. The results obtained in this thesis suggest that the Greatwall-Endosulfine-PP2A/B55 signalling pathway acts as a key regulator of Tf2 retrotransposons during entry into quiescence in S. pombe, by coordinating codon-biased translation of essential repressors involved in transcriptional silencing, nuclear organization, and autophagic degradation. In the absence of Endosulfine, sustained PP2A activity disrupts TORC2-Gad8 signalling and impairs tRNA modifications, leading to reduced translation of proteins highly enriched in AAA lysine codons. Among these are Tf2 repressors (Cbp1/Abp1, Set1C subunits, HDACs), the nuclear envelope protein Lem2, and autophagy-related factors Atg2 and Atg4. This dysfunction results in increased Tf2 expression, elevated histone acetylation at Tf2 loci, accumulation of viral-like particles, and increased retrotransposon mobilization. Mobilized Tf2 elements preferentially reintegrate into existing Tf2 loci or intergenic or ncRNA-rich regions, suggesting a potential role in transcriptional stress response. However, when silencing, nuclear organization, and degradation mechanisms fail, Tf2 activation may become deleterious, promoting genomic instability and compromising cell survival during quiescence. These findings highlight the importance of post-transcriptional regulation and codonspecific regulated translation in the control of transposable elements during stress adaptation.; [ES] En Schizosaccharomyces pombe, la entrada en quiescencia se produce en respuesta a privación de nitrógeno. En estas condiciones, las células proliferativas completan dos divisiones consecutivas sin crecimiento y se detienen en la fase G1, entrando finalmente en un estado quiescente G0. La ruta conservada Greatwall-Endosulfina-PP2A/B55 (GEP) actúa como un sensor molecular clave que transmite la señal de ausencia de nitrógeno a la maquinaria del ciclo celular, acelerando las divisiones finales necesarias para la entrada en quiescencia. Tras la inactivación de TORC1, el interruptor Greatwall-Endosulfina se activa, lo que lleva a la inhibición de la fosfatasa PP2A/B55. Esta inhibición facilita la fosforilación de los sustratos de Cdk1/Ciclina B para la entrada en mitosis, así como la activación de los sustratos de TORC2, como el ortólogo de AKT Gad8, promoviendo la entrada en mitosis, en quiescencia y la diferenciación sexual. La ausencia de nitrógeno también desencadena una transición entre las actividades de TORC1 y TORC2. Las modificaciones de ARNt dependientes de Elongator son esenciales para esta transición en respuesta a las condiciones nutricionales, ya que promueven la traducción eficiente de ARNm enriquecidos en codones AAA, incluidos aquellos que codifican activadores de TORC2 (tor1, ste20, gad8) e inhibidores de TORC1 (tsc1, tsc2, npr2, npr3). Simultáneamente, TORC2 activa a Elongator mediante la inhibición de Gsk3, a través de la fosforilación de Elp4 en la serina 114 mediada por Gad8. Esto establece un bucle de retroalimentación positiva entre TORC2 y Elongator, reforzando la transición de TORC1 a TORC2. Recientemente se ha demostrado que la ruta GEP regula esta transición durante la entrada en quiescencia al activar las modificaciones de ARNt dependientes de Elongator en el bucle del anticodón, aumentando la eficiencia y fidelidad en la traducción de ARNm enriquecidos en codones AAA para la lisina frente a AAG. En ausencia de nitrógeno, la activación de la ruta GEP permite una inhibición adecuada de PP2A/B55, lo que resulta fundamental para la acumulación de Gad8 fosforilado y la activación completa de TORC2. TORC2 promueve entonces la actividad de Elongator, estableciendo el bucle de retroalimentación positiva entre ambos. En células carentes de Endosulfina, esta cascada reguladora se ve interrumpida: PP2A/B55 permanece activa, la fosforilación de Gad8 se reduce y la función de Elongator se ve comprometida. En consecuencia, disminuyen los niveles de modificaciones críticas de los ARNt, lo que conlleva una traducción ineficiente de transcritos específicos implicados en la señalización TOR y en la arquitectura nuclear. Estas modificaciones son clave para la traducción de ARNm esenciales en el anclaje telomérico a la envuelta nuclear y en la represión de los genes subteloméricos. Además de la desrepresión subtelomérica, los mutantes de Greatwall y Endosulfina presentan una sobreexpresión de genes de los retrotransposones Tf2 durante la privación de nitrógeno. Los elementos transponibles constituyen una parte significativa de los genomas eucariotas, siendo los retrotransposones una subclase importante con capacidad para transcribirse e integrarse en el genoma del hospedador. La inserción de ADNc derivado de retrotransposones es intrínsecamente mutagénica y representa una amenaza para la integridad genómica. Por tanto, la actividad de los retrotransposones debe estar estrictamente regulada a lo largo del ciclo de vida del organismo para preservar la estabilidad del genoma. En esta tesis doctoral se ha investigado el papel de la ruta Greatwall-Endosulfina-PP2A/B55 en la represión de los retrotransposones Tf2 durante la entrada en quiescencia en Schizosaccharomyces pombe. Concretamente, este trabajo se centra en: (1) analizar el efecto de la pérdida de Endosulfina sobre la expresión, formación de partículas y movilización de los Tf2 bajo condiciones de ausencia de nitrógeno; (2) determinar cómo el sesgo hacia los codones AAA para la lisina influye en la traducción de proteínas implicadas en la regulación de los Tf2; y (3) evaluar si la ausencia de Endosulfina conduce a un aumento de las inserciones de los Tf2 y examinar sus posibles consecuencias adaptativas o perjudiciales durante la quiescencia. Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la ruta de señalización Greatwall- Endosulfina-PP2A/B55 actúa como un regulador clave de los retrotransposones Tf2 durante la entrada en quiescencia en S. pombe, al coordinar la traducción de represores de los Tf2, implicados en la represión transcripcional, la organización nuclear y la degradación autofágica, con alto contenido en el codón AAA para la lisina. En ausencia de Endosulfina, la actividad sostenida de PP2A reduce la señalización TORC2-Gad8 y deteriora las modificaciones de tRNA, lo que provoca una disminución en la traducción de proteínas altamente enriquecidas en codones AAA para la lisina. Entre ellas se encuentran represores de los Tf2 (Cbp1/Abp1, subunidades de Set1C, HDACs), la proteína de la envuelta nuclear Lem2 y proteínas de autofagia como Atg2 y Atg4. Esta disfunción provoca un aumento en la expresión de Tf2, una mayor acetilación de histonas en sus locus, acumulación de partículas tipo viral y una mayor movilización de los Tf2. Los elementos Tf2 movilizados tienden a reintegrarse en los locus de Tf2 preexistentes o en regiones intergénicas o en regiones ricas en ARN no codificantes, lo que sugiere un posible papel en la respuesta transcripcional al estrés. Sin embargo, cuando fallan los mecanismos de represión, organización nuclear y degradación, la activación de los Tf2 puede volverse perjudicial, promoviendo la inestabilidad genómica y comprometiendo la supervivencia celular durante la quiescencia. Estos resultados resaltan la importancia de la regulación post-transcripcional y de la traducción regulada de manera codón-específica en la represión de los retrotransposones Tf2 bajo condiciones de estrés. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/167136 [EN] In physiological conditions, the brain primarily uses glucose as a metabolic fuel, and it does it in a highly compartmentalized manner between different cell types. Astrocytes are potent glycolytic cells, producing substantial amounts of pyruvate that is converted to lactate. Lactate is then transferred to neurons, where it is transformed back to pyruvate to fuel the tricarboxylic acid cycle. Since the inner mitochondrial membrane is impermeable to pyruvate, it enters to the mitochondrial matrix through the mitochondrial pyruvate carrier (MPC). Recent findings suggest that MPC modulation drives the metabolic reprogramming of different tissues, impacting pathways like fatty acid and glutamine metabolism. Given the central role of glucose and pyruvate in brain bioenergetics, our main objective is to understand MPC role in astrocytic metabolism, and how MPC modulation can impact on neuronal physiology and mouse cognitive performance. Our results show that MPC ablation in astrocytes does not have dramatic effect on their survivability at a resting state, since these cells were able to shunt pyruvate entry to the mitochondria through alanine transamination. Additionally, reduced ketogenesis and increased glycolysis allowed to maintain critical bioenergetic parameters unaffected. However, in energy demanding conditions, mitochondrial pyruvate uptake resulted to be necessary to maintain cellular respiration. In these conditions, fatty acids, glutamine and succinate arose as alternative bioenergetic fuel. Deleting MPC in astrocytes compromised mouse survival, impaired higher-order brain functions, and altered neuronal activity. On top of that, the levels of key metabolites and neurotransmitters were disrupted when astrocytic mitochondria lack the ability to uptake pyruvate. Our findings give a key role to mitochondrial pyruvate metabolism in astrocytes to maintain the correct balance of neuronal function and brain physiology.; [ES] En condiciones fisiológicas, el cerebro utiliza principalmente glucosa como combustible metabólico, y lo hace de manera altamente compartimentada entre distintos tipos celulares. Los astrocitos son células glucolíticas potentes, que producen cantidades significativas de piruvato, el cual se convierte en lactato. Este lactato es transferido a las neuronas, donde se transforma de nuevo en piruvato para alimentar el ciclo del ácido tricarboxílico. Dado que la membrana mitocondrial interna es impermeable al piruvato, este ingresa a la matriz mitocondrial a través del transportador mitocondrial de piruvato (MPC). Hallazgos recientes sugieren que la modulación del MPC impulsa la reprogramación metabólica de distintos tejidos, afectando vías como el metabolismo de ácidos grasos y glutamina. Considerando el papel central de la glucosa y el piruvato en la bioenergética cerebral, nuestro objetivo principal es comprender el rol del MPC en el metabolismo astrocítico y cómo su modulación impacta en la fisiología neuronal y el desempeño cognitivo en ratones. Nuestros resultados demuestran que la ablación de MPC en astrocitos no tiene un efecto drástico en su supervivencia en estado basal, ya que estas células logran desviar la entrada de piruvato a las mitocondrias mediante la transaminación de alanina. Además, la reducción de la cetogénesis y el aumento de la glucólisis permiten mantener los parámetros bioenergéticos críticos sin alteraciones. Sin embargo, en condiciones de alta demanda energética, la captación mitocondrial de piruvato resultó ser necesaria para sostener la respiración celular. En estos casos, los ácidos grasos, la glutamina y el succinato intervienen también como combustibles bioenergéticos alternativos. La eliminación de MPC en astrocitos comprometió la supervivencia de los ratones, deterioró funciones cerebrales superiores y alteró la actividad neuronal. Asimismo, los niveles de metabolitos clave y neurotransmisores se vieron alterados cuando las mitocondrias astrocíticas perdieron la capacidad de importar piruvato. Estos hallazgos otorgan un papel clave al metabolismo mitocondrial de piruvato en astrocitos para mantener el equilibrio correcto de la función neuronal y la fisiología cerebral. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/164994 [ES]Aunque todas las cifras incluyen al ictus hemorrágico, el ictus isquémico supone la gran mayoría de todos los ictus que se dan en el mundo. Representa el 65,3% de todos los ictus de forma global, y hasta el 74,9% de los ictus en países de altos ingresos (Feigin et al., 2024). El ictus isquémico se caracteriza por el cese o la disminución brusca del aporte sanguíneo en un área concreta del cerebro. Este cese se debe a una oclusión arterial, que puede estar provocada por un embolismo cardiaco, un embolismo arterial (placas de ateroma) o por una estenosis arterial in situ (Campbell et al., 2019; Campbell & Khatri, 2020). Existen otras etiologías menos frecuentes que también pueden interrumpir el flujo sanguíneo cerebral, como son la oclusión brusca de arterias penetrantes, las arteritis, la disección arterial o algunos trastornos genéticos o hematológicos (Brouns & De Deyn, 2009; Campbell & Khatri, 2020). 2025-04-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/164992 [ES]La meiosis representa una forma especializada de división celular en la que una célula progenitora diploide experimenta dos divisiones secuenciales de reducción cromosómica, conocidas como meiosis I y meiosis II, culminando en la generación de cuatro células haploides denominadas gametos. A lo largo de este proceso, los eventos cruciales de apareamiento y recombinación del ADN entre cromosomas homólogos promueven la diversidad genética. Estos apareamientos son facilitados por fuerzas del citoesqueleto, que inducen movimientos cromosómicos durante la profase meiótica. Observaciones previas a este trabajo han indicado ligeras variaciones en las trayectorias de estos movimientos, cuya significancia biológica sigue siendo un misterio. Mediante la utilización de ChroMo (del inglés, Chromosome Movements) , una metodología computacional desarrollada en nuestro laboratorio para investigar específicamente los movimientos cromosómicos, hemos detectado un patrón de movimiento único denominado motivo C. Este patrón de movimiento surge especialmente en presencia de daño persistente en el ADN, además, la presencia del motivo C se ve enriquecida cuando Rdh54, una translocasa de ADN dependiente de ATP, está ausente. De manera similar, los meiocitos silvestres tratados con hidroxiurea también exhiben estos motivos con mucha frecuencia, en contraste con las células silvestres no tratadas con esta droga. La presencia del motivo C en células rdh54Δ depende de la quinasa del punto de control de daño ATR; Rad3. Relevantemente, hemos observado que las células rdh54Δ que presentan el motivo C pueden progresar a través de la meiosis, mientras que aquellas que carecen de estas micro variaciones no logran hacerlo, lo que sugiere una relevancia biológica para estas perturbaciones. Hipotetizamos que estos motivos pueden funcionar como un mecanismo de reinicio o redirección del movimiento cromosómico a través de la catástrofe de microtúbulos, facilitando potencialmente la reparación del ADN.; [EN]Meiosis represents a specialized form of cell division where a diploid progenitor cell undergoes two sequential reductional divisions, commonly known as meiosis I and meiosis II, culminating in the generation of four haploid cells known as gametes. Throughout this process, the crucial events of DNA pairing and recombination between homologous chromosomes promote genetic diversity. These pairings are facilitated by cytoskeletal forces, which induce substantial chromosome movements during the meiotic prophase. Previous observations have indicated slight variations in the trajectories of these movements, whose biological significance remains a mystery. Through the utilization of ChroMo (Chromosome Movements), a computational methodology developed in our laboratory specifically for investigating chromosome movements, we have detected a unique motion pattern referred to as motif C. This motion pattern arises upon persistent DNA damage, specifically the presence of the motif C is enriched when Rdh54, an ATP-dependent DNA translocase, is deleted. Similarly, wild-type meiocytes treated with hydroxyurea also exhibit these motifs, in contrast to non-treated wild-type cells. The presence of motif C in rdh54Δ cells depends on the ATR checkpoint kinase Rad3. Intriguingly, we have observed that rdh54Δ cells exhibiting motif C can progress through meiosis, whereas those lacking these microvariations are unable to do so, suggesting a biological significance for these perturbations. We hypothesize that these motifs may function as a reset mechanism for movement through microtubule catastrophe, potentially facilitating DNA repair. 2025-04-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/164965 [EN]Eukaryotic RNA polymerase II (RNAPII), the enzyme responsible for the synthesis of all messenger RNAs (mRNAs) and specific classes of non-coding RNAs (ncRNAs), consists of twelve subunits. Among them, Rpb4 and Rpb7 subunits form a heterodimeric (Rpb4/7) domain called “stalk”, which, at least in Saccharomyces cerevisiae, has a remarkable functional versatility. It is involved in several processes throughout the transcription cycle: it modulates RNAPII activity during transcription initiation and elongation, facilitates Rpb1-CTD dephosphorylation, is essential for gene loops formation and is required for the recruitment of termination/3'-end processing factors. In addition, Rpb4/7 has the ability to bind the mRNA (imprinting) and dissociate from the 10-subunit core upon transcription termination. Furthermore, Rpb4/7 transits to the cytoplasm, along with mRNAs, where it influences their translation and decay. However, the molecular mechanisms orchestrating these diverse nuclear and cytoplasmic functions remain poorly understood. In this study, we demonstrate that Rpb4 is a phosphoprotein, whose phosphorylation serves as a crucial regulatory mechanism coordinating transcription with post-transcriptional processes. We have identified five phospho-sites within Rpb4 protein sequence and showed that their modifications impair multiple aspects of gene expression. Inefficient Rpb4 phosphorylation leads to increased Rpb4 association with RNAPII, particularly at the genes 3'-ends, affects transcription elongation, polyadenylation site selection, and snoRNA termination. We identified the kinase Hrr25 and phosphatase Fcp1, known regulators of Rpb1-CTD phosphorylation levels, as key modulators of Rpb4 phosphorylation levels as well. Using RNA immunoprecipitation coupled with sequencing, we reveal that Rpb4 phosphorylation influences Rpb4/7 RNA-binding specificity and demonstrate altered association patterns with specific transcript populations. Proteomic analysis reveals altered interactions between Rpb4 and components of the translation machinery and, particularly, reduced association with ribosomal proteins and ribosome assembly factors. Moreover, widespread transcriptional changes affect approximately 30% of the yeast transcriptome, largely involved in translation-related processes and ribosome biogenesis. Altogether our findings point out to a role of Rpb4 phosphorylation as a molecular switch controlling its transition between nuclear and cytoplasmic functions through modulation of its interactions with RNAPII, RNA, and a variety of regulatory factors, thereby ensuring accurate coordination between transcription and post-transcriptional processes.; [ES]La ARN polimerasa II eucariótica (ARNPII), la enzima responsable de la síntesis de todos los ARN mensajeros (ARNm) y de algunas otros ARN no codificantes, está compuesta por doce subunidades. Entre ellas, las subunidades Rpb4 y Rpb7 forman un dominio heterodimérico (Rpb4/7) denominado "stalk" que, al menos en Saccharomyces cerevisiae, presenta una notable versatilidad funcional. Está implicado en diversos procesos a lo largo del ciclo de transcripción: modula la actividad de la ARNPII durante la iniciación y elongación de la transcripción, facilita la defosforilación del CTD de Rpb1, es esencial para la formación de bucles génicos y es necesario para el reclutamiento de factores de terminación y procesamiento del extremo 3'. Además, Rpb4/7 tiene la capacidad de unirse al ARNm (imprinting) y disociarse del núcleo de 10 subunidades tras la terminación de la transcripción. A su vez, Rpb4/7 se transloca al citoplasma junto con los ARNm, donde regula su traducción y degradación. Sin embargo, los mecanismos moleculares que coordinan esta variedad de funciones nucleares y citoplasmáticas no están completamente caracterizados. En este estudio, hemos demostrado que Rpb4 es una fosfoproteína cuya fosforilación actúa como un mecanismo regulador crucial que coordina la transcripción con los procesos postranscripcionales. Hemos identificado cinco sitios de fosforilación en la secuencia proteica de Rpb4 y demostrado que su fosforilación afecta a múltiples aspectos de la expresión génica. La fosforilación ineficiente de Rpb4 conduce a un aumento de la asociación de Rpb4 con la ARNPII, particularmente en los extremos 3' de los genes, afecta a la elongación de la transcripción, a la selección del sitio de poliadenilación y a la terminación de los ARN nucleolares pequeños (snoRNAs). Hemos identificado a la quinasa Hrr25 y a la fosfatasa Fcp1, conocidos reguladores de los niveles de fosforilación del CTD de Rpb1, como moduladores claves de la fosforilación de Rpb4. Mediante inmunoprecipitación de ARN acoplada a secuenciación, hemos descubierto que la fosforilación de Rpb4 influye en la especificidad de unión al ARN de Rpb4/7 y mostrando patrones de asociación alterados con poblaciones específicas de transcritos. El análisis proteómico ha revelado interacciones alteradas entre Rpb4 y componentes de la maquinaria de traducción y, particularmente, una reducción en la asociación con proteínas ribosomales y factores de ensamblaje del ribosoma. Además, se producen cambios transcripcionales generalizados que afectan aproximadamente al 30% del transcriptoma de levadura, principalmente implicados en procesos relacionados con la traducción y la ribogénesis. En conjunto, nuestros hallazgos señalan que la fosforilación de Rpb4 actúa como un interruptor molecular que controla su transición entre funciones nucleares y citoplasmáticas mediante la modulación de sus interacciones con la ARNPII, el ARN y diversos factores reguladores, asegurando así una coordinación precisa entre la transcripción y los procesos postranscripcionales. 2025-03-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/163660 [ES]Cuando las células de Schizosaccharomyces pombe se cultivan en medios ricos en nitrógeno, el ciclo celular se caracteriza por tener una fase G2 larga, durante la cual las células crecen hasta alcanzar el tamaño necesario para entrar en mitosis. Tras la división, las células poseen el tamaño umbral mínimo requerido para entrar en fase S, por lo que el punto de control G1/S es críptico en estas condiciones. En contraste, cuando las células se cultivan en medios pobres en nitrógeno, su ciclo celular se reprograma inmediatamente, la fase G2 se acorta y las células se dividen con un tamaño menor. Como consecuencia, las células extienden la fase G1 hasta alcanzar el tamaño necesario para que se produzca la duplicación del ADN, cobrando importancia el punto de control de tamaño G1/S. En ausencia total de nitrógeno, las células se dividen dos veces sin crecimiento y se bloquean en G1 para entrar en estado de quiescencia. La quiescencia es un estado reversible, conservado en eucariotas, que se caracteriza por una reducción del tamaño celular, un aumento de la resistencia a estrés, inducción de la autofagia, menor tasa de transcripción y traducción y aumento de longevidad. Tanto en condiciones de medios pobres en nitrógeno como en quiescencia, cuando las células extienden la fase G1 o se bloquean en esta fase, respectivamente, la maquinaria que promueve la transición G1/S ha de inactivarse. En S. pombe, la transición G1/S depende del complejo MBF, el ortólogo funcional de E2F y SBF/MBF en metazoos y Saccharomyces cerevisiae, respectivamente. La transcripción dependiente de E2F y SBF es inhibida por Rb en metazoos y Whi5 en S. cerevisiae, mediante el reclutamiento de los complejos histonas deacetilasas, HDAC1 o Rpd3, que deacetilan histonas de los promotores de sus genes diana. En S. pombe, el factor de transcripción que activa la expresión de los genes de fase S se denomina complejo MBF, ortólogo funcional de E2F en metazoos, y está compuesto por las subunidades Cdc10, Res1, Res2 y el co-activador Rep2. En meiosis, el complejo MBF se altera y se compone únicamente por Cdc10 y Res2, mientras que Rep1 se convierte en su co-activador. El complejo MBF está unido a los promotores de sus genes diana a lo largo del ciclo, y está regulado para restringir su actividad a la transición G1/S. Nrm1 y Yox1 actúan como represores al final de fase S y durante la fase G2. Sin embargo, se desconoce el mecanismo de represión del complejo MBF en situaciones en las que la fase G1 se extiende. Puesto que S. pombe posee una proteína, Whi5, que ha sido predicha como un represor de la transición G1/S, en esta Tesis Doctoral se ha propuesto estudiar la posible implicación de Whi5 en la inhibición de la transcripción dependiente del complejo MBF. Concretamente este trabajo se centra en: (1) estudiar el papel de Whi5 como represor del complejo MBF en células quiescentes, (2) estudiar el rol de Whi5 como represor de la transición G1/S en medios pobres en nitrógeno, (3) identificar las proteínas que interaccionan con Whi5 en células quiescentes y (4) estudiar el papel de las histonas deacetilasas en la represión de la expresión dependiente de MBF en quiescencia. Nuestros datos sugieren que Whi5 regula la transición G1/S en células cultivadas en medios pobres en nitrógeno. En estas condiciones, Whi5 se localiza en el núcleo y la sobreexpresión de whi5 mimetiza las deleciones de componentes del complejo MBF, como rep2 o res1, generando estrés replicativo y daño en el ADN, probablemente como consecuencia de una disminución de la actividad del complejo MBF. En contraste, la deleción de whi5 rescata los fenotipos de rep2∆ o res1∆, probablemente debido a un aumento de la actividad del complejo MBF. En células quiescentes, Whi5 se transloca al núcleo y reprime la expresión de genes dependientes del complejo MBF, concretamente, de genes de meiosis temprana. Acorde con este resultado, Whi5 interacciona específicamente con el complejo MBF formado por Cdc10 y Res2, aunque en quiescencia Res1 también forma parte del complejo. En último lugar, se determinó que Whi5 media el reclutamiento del complejo HDAC Clr6-I hacia los promotores de los genes dependientes del complejo MBF, promoviendo su desacetilación en un mecanismo conservado en S. cerevisiae y metazoo; [EN]When Schizosaccharomyces pombe cells are grown in nitrogen-rich medium, they divide with a large cell size after a long G2 phase. After division, cells possess the required size threshold to enter S phase. As a consequence, the G1/S checkpoint is cryptic under these conditions. In contrast, when cells are grown in nitrogen-poor media, the cell cycle is immediately reprogrammed, the G2 phase is shortened and cells divide with a smaller cell size. As a result, an extension of the G1 phase occurs, until cells reach the minimum size necessary for DNA duplication. In the total absence of nitrogen, cells divide twice without growth and undergo a cell cycle arrest in G1, before becoming quiescent cells. Quiescence is a cell cycle stage conserved in eukaryotes that is characterized by reversible cell cycle arrest in G1 phase, reduction in cell size, increased stress resistance, reduced transcription and translation, induction of autophagy and increased longevity. In nitrogen-poor media, when cells extend G1 phase, and in quiescence, when cells are blocked in G1 phase, the machinery that promotes the G1/S transition must be inactivated. In fission yeast, the transcription factor that activates the expression of S-phase genes is the MBF complex, the functional homologue of E2F in metazoans and MBF/SBF in S. cerevisiae. E2F and SBF-dependent transcription is inhibited by Rb in metazoans and Whi5 in S. cerevisiae, through recruitment of histone deacetylase complexes, HDAC1 or Rpd3, which deacetylate histones in the promoters of their target genes. In S. pombe the MBF complex consists of Cdc10, Res1, Res2 and Rep2 subunits. During meiosis, the MBF complex is disrupted and it consists of Cdc10, Res2, and Rep1 as a co-activator. The MBF complex is bound to its target genes promoters throughout the cell cycle and it is regulated to limit its activity during the G1/S transition. Nrm1 and Yox1 function as repressors at the end of S phase and during G2. Nevertheless, the repression mechanism of the MBF complex during G1 phase remains unclear. S. pombe possesses a protein, Whi5, predicted to act as a repressor of the G1/S transition. In this Doctoral Thesis we investigate the potential role of Whi5 in inhibiting MBF-dependent transcription. Specifically, this work focuses on: (1) examining the role of Whi5 as a repressor of the MBF complex in quiescent cells, (2) studying Whi5 function as a repressor of the G1/S transition under nitrogen-poor conditions, (3) identifying Whi5 interactors in quiescent cells, and (4) exploring the role of histone deacetylases in repressing MBF-dependent expression during quiescence. Our data suggest that Whi5 regulates the G1/S transition in cells cultured in nitrogen-poor media. Under these conditions, Whi5 localizes to the nucleus, and overexpression of whi5 mimics the deletions of MBF complex components, such as rep2 or res1, resulting in replicative stress and DNA damage, probably due to reduced MBF complex activity. In contrast, deletion of whi5 rescues the phenotypes associated with rep2∆ or res1∆, probably due to an increase in MBF activity. After induction of quiescence by nitrogen starvation, Whi5 protein is localized to the nucleus and represses the expression of MBF-dependent genes, specifically early meiosis genes. Consistent with this finding, Whi5 physically interacts with the MBF complex composed of Cdc10 and Res2, although Res1 is also part of the complex in quiescent cells. Finally, it was determined that Whi5 has a role in maintaining transcriptional repression of MBF-dependent genes in quiescence by the recruitment of the Clr6-I complex to gene promoters, promoting their deacetylation in a conserved mechanism in S. cerevisiae and metazoans 2024-12-13T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/161178 [ENG]Cells are constantly exposed to different endogenous and exogenous agents that can produce lesions in the gene7c material. Within all the types of DNA damage, double-strand breaks are the most damaging type of injury to the cell. In response to this damage, cells have developed a set of processes collec7vely known as the DNA Damage Response (DDR). One of the ini7al steps in homologous recombina7on (HR) is DNA-end resec7on. It involves the degrada7on of one DNA strand on both sides of the DSB in the 5'-3’ sense, genera7ng single-stranded DNA (ssDNA). Subsequently, different proteins bind to this ssDNA forming a protofilament capable of searching for homology and invading the template strand. While many proteins involved in these processes are regulated through phosphoryla7on by protein kinases, litle is known about the role of protein phosphatases in these mechanisms. The role of cyclin-dependent kinase (CDK) in regula7ng numerous mechanisms in response to DNA damage has been extensively studied. Since Cdc14 is the only known phosphatase that antagonizes Cdk, it is reasonable to think that its func7on is also crucial in regula7ng these processes. Thus, the absence of Cdc14 ac7vity lead s to excessive resec7on and genomic instability, sugges7ng a potencial role for the phosphatase in nega7vely regula7ng this process to temporally restrain resec7on progression and ensure an accurate DNA repair via homologous recombina7on. Addi7onally, high-throughput sequencing analyses have allowed for the inves7ga7on of various aspects of DNA repair at the nucleo7de level, including the extent of resec7on, its direc7onality, and the gene conversion events generated during lesion repair. Interes7ngly, the removal of Dna2 ac7vity or the disrup7on of its Cdk phosphoryla7on sites prevents the over-resec7on phenotype observed in the absence of the phosphatase, sugges7ng that Cdc14 nega7vely regulates resec7on by controlling the Sgs1/Dna2 complex. Curiously, only the mito7cally ac7vated Cdc14 (FEAR and MEN), but not DNA damage-dependent Cdc14 ac7va7on, dephopshorylates Dna2. Addi7onally, the dissolu7on of Dna2 foci, as observed by fluorescence microscopy, occurs exclusively during mitosis, sugges7ng that only mito7c ac7va7on of Cdc14 inhibits resec7on. In summary, these results demonstrate that the Cdk/Cdc14 module func7ons as a molecular switch that acts on the exonuclease Dna2 to regulate the proper extension of singlestranded DNA ends generated during resec7on, ensuring the accurate restora7on of the DNA molecule. 2024-11-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/161088 [SPA]La meiosis es una división especializada que asegura la transmisión fiel del genoma a una descendencia viable en organismos con reproducción sexual. En concreto, la meiosis es crucial para mantener la ploidía de las especies porque reduce el número de cromosomas a la mitad, produciendo cuatro gametos haploides a partir de una célula progenitora diploide (Bolcun-Filas & Handel, 2018; Zickler & Kleckner, 2023). Para ello, incluye una ronda de replicación del ADN seguida de dos rondas consecutivas de segregación cromosómica denominadas meiosis I (MI, segregación de homólogos) y meiosis II (MII, segregación de cromátidas hermanas). Además, esta división también es esencial para la evolución de las especies ya que genera variabilidad genética de dos maneras. En primer lugar, combinando los cromosomas maternos y paternos de diferentes maneras en los gametos y, en segundo lugar, intercambiando material genético entre los homólogos durante la recombinación meiótica, creando así nuevas combinaciones de alelos. Además de aumentar la heterogeneidad genética, la recombinación meiótica que ocurre durante profase cumple otra función crucial: garantiza la correcta disyunción de los homólogos en MI y, de este modo, asegura que los cromosomas se distribuyan correctamente en gametos viables. Los crossovers (COs) resultantes de la recombinación unen cada par de homólogos en el quiasma, y la tensión proporcionada por esta conexión favorece la correcta biorientación y segregación opuesta de los cromosomas homólogos en la MI. En ausencia de COs y quiasmas, es probable que los homólogos se orienten mal y segreguen ambos en la misma dirección produciendo gametos aneuploides que pueden ser inviables o dar lugar a una descendencia defectuosa (Petronczki et al., 2003; Székvölgyi & Nicolas, 2010). Mecanismo de recombinación meiótica en S. pombe: durante profase meiótica, la recombinación se inicia con roturas de doble cadena (DSBs) introducidas en el ADN por la endonucleasa Spo11 (Rec12 en S. pombe) de manera controlada y deliberada. Tras el procesamiento y resección de los extremos 5’, se generan tramos 3' de ADN de cadena sencilla donde las recombinasas Rad51 y Dmc1 se cargan ensamblando un nucleofilamento helicoidal que lleva a cabo la búsqueda e invasión de una secuencia homóloga adecuada para la reparación (Brown & Bishop, 2015). La invasión del molde da lugar a la estructura del D-loop (displacement loop), que puede implicar bien a una cromátida homóloga (interhomolog, IH) o a la hermana (intersister, IS) en función de la elección del molde. En este punto, el proceso de reparación puede tomar dos destinos. En primer lugar, el D-loop puede desestabilizarse o deshacerse por la acción de helicasas y la rotura se repara mediante Synthesis Dependent Strand Annealing (SDSA), esta vía produce exclusivamente non-crossovers(NCO) que pueden contener intercambios no recíprocos al copiar la secuencia del homólogo para la reparación (conversión 140 génica, GC) (Lorenz, 2017; Lorenz et al., 2014). En el otro destino, el D-loop se estabiliza generando intermediarios o joint molecules (JM) que maduran en la Holliday junction (HJ). En S. pombe, las HJs se resuelven por la endonucleasa selectiva de estructura (SSE) Mus81-Eme1 generando un NCO o un CO dependiendo de las hebras cortadas. Esta resolución está sesgada para asegurar suficientes COs dada su relevancia para la segregación. De hecho, la cantidad y distribución de COs está controlada en la mayoría de organismos por distintos mecanismos que regulan su distribución homogénea y aseguran que se forme al menos un CO entre cada par homólogo (Pazhayam et al., 2021; S. Wang et al., 2015; Zickler & Kleckner, 2016). A parte de la formación de COs, otro punto crítico de la meiosis es la resolución de JMs (joint molecules) o intermediarios ramificados de recombinación antes de MI. Si los intermediarios persisten más allá de profase, mantienen los cromosomas sin reparar y conectados erróneamente durante anafase I, lo cual impide su correcta segregación y, en última instancia, produce gametos aberrantes o inviables (Hunter, 2015; San-segundo & Clemente-blanco, 2020; Wyatt & West, 2014). Existen distintas proteínas que procesan y resuelven estas JMs, como SSEs y helicasas; además, estos sistemas suelen ser más relevantes en fases tardías de la meiosis y algunos están regulados temporalmente por mecanismos dependientes del ciclo celular (Alonso-Ramos et al., 2021; Gallo-Fernández et al., 2012; Grigaitis et al., 2020; Matos et al., 2011). Entre los sistemas implicados en la eliminación de la JM, algunas proteínas garantizan específicamente que los nucleofilamentos de la recombinasa se desmantelen tras la invasión productiva para permitir la progresión de la reparación, como es el caso en S. pombe de la F-box DNA helicasa Fbh1 junto con su cargador Dbl2 (Polakova et al., 2016; Sun et al., 2011). Actividad recombinasa y el factor auxiliar Swi5-Sfr1 Durante el proceso de recombinación, las recombinasas realizan un paso clave: la invasión del molde homólogo que permite la reparación fiel de la información genética. La mayoría de los eucariotas tienen dos recombinasas, Rad51 (también llamada Rhp51 en S. pombe) y Dmc1, que pertenecen a la familia bacteriana RecA. Rad51 y Dmc1 son esenciales para la meiosis en diferentes organismos. Su ausencia conduce generalmente a una reparación defectuosa de las DSBs, a segregaciones cromosómicas aberrantes e incluso al bloqueo del ciclo meiotico, lo que a menudo resulta en gametos inviables e infertilidad (Brown & Bishop, 2015). La actividad de Rad51 (y Dmc1) depende de su actividad ATPasa y de varias proteínas que modulan la dinámica de los nucleofilamentos. Estos factores pueden clasificarse en tres categorías: proteínas de unión a ADN de cadena sencilla (SSBs, ssDNA binding proteins), factores auxiliares/accesorios de las recombinasas (RAFs) y helicasas/translocasas de ADN (Liu, Ehmsen et al., 2011). Específicamente, el segundo grupo (RAFs), incluye varias proteínas y complejos que contribuyen a la formación de nucleofilamentos y/o a su actividad catalítica de diferentes maneras. Entre ellos, el complejo Swi5-Sfr1 es uno de los RAF de Rad51 (y Dmc1) más relevantes. Está bien conservado a lo largo de la evolución, desde las levaduras hasta los humanos, y se ha estudiado molecularmente de forma exhaustiva en levaduras de fisión y otros organismos (Argunhan, Murayama & Iwasaki et al., 2017). Swi5- Sfr1 estimula la actividad recombinasa de Rad51 y Dmc1 mediante dos mecanismos. En primer lugar, gracias a su estructura alargada y curvada se inserta en el surco helicoidal estabilizando el nucleofilamento en su forma activa (unido a ATP) e impidiendo su disociación y, en segundo lugar, estimula la actividad ATPasa de Rad51 (y Dmc1) necesaria para la invasión del molde homólogo. Dada esta función de Swi5-Sfr1, su ausencia impide la recombinación homóloga en mitosis y en meiosis in vivo, afectando específicamente en meiosis a la invasión y recombinación con el cromosoma homólogo (Hyppa & Smith, 2010). Swi5-Sfr1 como posible sustrato de CDK en meiosis Las quinasas dependientes de ciclina (CDK) ordenan la progresión del ciclo celular en mitosis y en meiosis, y coordinan distintos procesos celulares con las distintas fases del ciclo. En meiosis, la actividad CDK está involucrada en eventos específicos como la arquitectura nuclear, la formación de DSBs, la recombinación y la sinapsis de los homólogos, aunque se conocen muy pocos sustratos involucrados (Palacios-Blanco & Martín-Castellanos, 2022). Las dianas reguladas por CDK en la reparación de daño y en el ADN han sido ampliamente documentadas en mitosis, pero no tanto en meiosis. Algunos de estos sustratos probablemente sean compartidos en ambos escenarios, mientras que otros serán exclusivos de eventos meióticos. Dado que evidencias previas del laboratorio sugerían que la actividad CDK participa de alguna forma en el procesamiento y reparación de DSB meióticos en S. pombe, buscamos posibles dianas de CDK en este proceso celular. Basándonos en que la secuencia de Sfr1 contiene 7 sitios consenso de fosforilación por CDK, en que algunos de estos sitios figuraban fosforilados in vivo en estudios fosfoproteómicos masivos en mitosis, y en la capacidad del RAF Swi5-Sfr1 para modular la recombinación, seleccionamos y estudiamos la proteína Sfr1 como candidata a ser fosforregulada por CDK. 2024-10-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/160514 [ES] El exómero es un complejo proteico tradicionalmente relacionado con el transporte de proteínas transmembrana desde el TGN hasta la MP. Sin embargo, algunos resultados sugieren que podría tener funciones adicionales. Algunos fenotipos de los mutantes del exómero, como alteraciones en la polaridad o sensibilidad a iones e higromicina, no se han podido adscribir a la retención en el Golgi de ninguna proteína transmembrana implicada en esos procesos (Anton et al., 2017; Hoya et al., 2017; Trautwein et al., 2006). En el caso de S. pombe no se ha encontrado ninguna proteína transmembrana, implicada en ninguno de los procesos estudiados, que se quede retenida en el TGN o se deslocalice en ausencia del exómero (Hoya et al., 2017). Esto potencia la idea de que en este organismo el exómero no es un adaptador de cargo clásico. Además, el hecho de que coopere tanto con AP-1 en el tráfico anterógrado a la MP, como con los GGAs en el tráfico hacia el PVE (Hoya, 2017) sugiere que podría participar en un proceso más general del tráfico vesicular que lo que correspondería a un adaptador específico de cargo. Esta cooperación también se ha descrito en S. cerevisiae (Anton-Plagaro et al., 2021), lo que sugiere que en la levadura de gemación el exómero podría tener una función de adaptador (la más caracterizada) y otra función más general. El hecho de que los mutantes carentes del exómero (cfr1Δ y bch1Δ) tengan varios fenotipos, aparentemente no relacionados, pero que ninguno de ellos sea muy penetrante apoya la idea de que el exómero de S. pombe pueda participar en algún proceso general, que afecte a varias funciones biológicas sin ser esencial para ninguna de ellas. Además, también estaría de acuerdo con el hecho de que en rastreos de 2-híbridos realizados usando Cfr1 o Bch1, prácticamente sólo se obtenga con el otro componente del exómero (nuestros resultados, y (Vo et al., 2016), y en rastreos tipo SGA o de proteómica no se hayan encontrado, de manera reproducible, genes/proteínas que participen en un proceso determinado. En resultados anteriores del laboratorio los mutantes del exómero de S. pombe presentaron defectos leves en: fusión celular durante la conjugación, tráfico de la carboxipeptidasa Y, composición de la pared celular, crecimiento en presencia de caspofungina, tunicamicina, DTT, higromicina, y algunas sales, y septación en presencia de KCl y sorbitol (Cartagena-Lirola et al., 2006; Hoya, 2016; Hoya et al., 2017; Moro, 2018; Moro et al., 2021). De entre la sensibilidad a sales, cabe destacar sensibilidad a CaCl2 y a sales de K+. En particular los mutantes son sensibles a KCl 0,6 M, KNO3 0,6 M y acetato de potasio 0,02 M. Sin embargo, los mutantes crecen bien en presencia de sorbitol 1,2 M, un medio con una osmolaridad similar a la de KCl 0,6 M (Moro et al., 2021), lo que indica que la ausencia del exómero provoca sensibilidad a estrés iónico pero no a estrés osmótico. Además, el sorbitol no mejora el crecimiento en presencia de KCl, y las células mutantes son capaces de recuperar su crecimiento normal al pasar de medio con KCl a medio sin KCl. Esto indica que la sensibilidad a KCl no es consecuencia de la lisis celular provocada por las alteraciones en la pared celular del mutante (Hoya et al., 2017; Moro et al., 2021). Además, los resultados iniciales obtenidos en el laboratorio indicaron que la ausencia del exómero provoca una activación anómala de la ruta de integridad celular. Un análisis inicial de la localización de Rgf1, una GEF de Rho1 y componente de la ruta de integridad, indicó que esta proteína se localiza en la superficie celular en las cepas WT y cfr1Δ, se deslocaliza tras 15 minutos de tratamiento con KCl y vuelve a recuperar su localización en la superficie celular en una cepa WT, pero es incapaz de hacerlo en la cepa mutante del exómero (Moro, 2018). También se vio que en condiciones de estrés iónico el sistema endosomal de las células mutantes del exómero tiene una morfología alterada, lo cual podría contribuir a los diversos fenotipos leves relacionados con el transporte vesicular y la homeostasis iónica que presentan estas células (Moro et al., 2021). 2024-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/159649 [ES]El genoma de las células eucariotas se condensa en el núcleo en forma de cromatina, siendo el nucleosoma la unidad básica de empaquetamiento. El octámero de histonas es el conjunto de proteínas estructurales que, junto con el DNA, forman los nucleosomas. Las histonas son indispensables para la correcta compactación de la cromatina. Están altamente conservadas a lo largo de la evolución y cada una suele estar codificada por varios genes, lo que pone de manifiesto su relevancia en la organización del genoma. Además, tienen un papel fundamental en la epigenética de las células. En algunas levaduras como Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe, los genes de las histonas se organizan en el genoma en forma de parejas divergentes. Esta circunstancia planteó la posibilidad de que las distintas copias fueran funcionalmente equivalentes. Por ello, hemos estudiado en S. pombe el efecto de las deleciones sencillas y dobles de histonas y de pares H3-H4, comprobando que, a medida que vamos delecionando genes, las consecuencias sobre la organización de los nucleosomas, el crecimiento o la expresión génica se ven fuertemente incrementadas. Esto nos lleva a pensar que todas las copias son necesarias para el correcto funcionamiento celular, y que no se comportan ni se regulan de la misma manera a pesar de codificar para las mismas proteínas. Por otro lado, hace algunos años se describió en nuestro laboratorio la existencia de una “huella” o signature nucleosómica, que representa un patrón de distribución de los nucleótidos específico en cada especie, capaz de dirigir el posicionamiento de los nucleosomas. Dado que las secuencias que posicionan nucleosomas en una especie no lo hacen cuando se introducen en el genoma de otra, nos preguntamos si un organismo podría vivir con las histonas de otro, y para comprobarlo realizamos sustituciones de algunas histonas por las de otros organismos próximos a nivel evolutivo, como S. octosporus y S. japonicus, y más alejados, como H. sapiens. Los resultados que hemos obtenido nos indican que la célula se ve afectada incluso ante cambios mínimos en la secuencia de las proteínas y que, en consecuencia, las histonas no parecen ser funcionalmente equivalentes, incluso entre especies del mismo género. Por último, y siguiendo la línea de algunos de los resultados obtenidos en los análisis de expresión diferencial de las cepas utilizadas en este trabajo, quisimos determinar si la epigenética de las células estaba afectada por las mutaciones en las histonas. Valoramos de manera específica la metilación en regiones heterocromáticas, que se reduce tanto en los mutantes de deleción como en los de intercambio, en los primeros por la reducción en la cantidad de histonas y en los segundos como consecuencia del cambio de proteínas. Esta reducción provoca la expresión de regiones silenciadas que conduce a la inestabilidad genómica. 2024-01-01T00:00:00Z