DMG. Tesis del Departamento de Microbiología y Genética

Caracterización molecular de la neurofibromatosis tipo 1 y el síndrome de Legius

Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT

[ES] Las RASopatías asociadas a alteraciones en los genes NF1 y SPRED1 presentan una marcada heterogeneidad clínica y molecular, donde el principal obstáculo tras el diagnóstico genético es la interpretación funcional de las variantes identificadas. Con el objetivo de superar este desafío, la presente tesis doctoral ha creado un flujo de trabajo experimental multidisciplinar que combina el análisis de variantes en NF1 y SPRED1 reportadas en bases de datos públicas y de pacientes de la DIERCyL, el modelado estructural y de estabilidad proteica in silico, la señalización celular, proliferación, y morfometría en las líneas celulares HEK293T y NIH3T3. Los análisis de las bases de datos genéticas identificaron hotspots estructurales críticos en la proteína neurofibromina (CSRD, GRD y Armadillo1), mientras que las variantes en SPRED1 mostraron una distribución homogénea, sugiriendo mecanismos patogénicos distintos. En el caso de las variantes en NF1 y SPRED1 de los pacientes, el análisis energético reveló un espectro continuo en neurofibromina que va desde haploinsuficiencia hasta dominancia negativa en truncantes tardías, mientras que en SPRED1 predominó la pérdida de función. Los ensayos celulares in vitro, mostraron dinámicas de señalización celular diferentes según el tipo de variante analizada en los genes NF1 y SPRED1. En particular, la hiperactivación de ERK emergió como el evento molecular más determinante para la patogenicidad de las variantes. La coactivación de p38 identificó variantes de mayor severidad clínica, mientras que la relación inversa p- ERK/p-AKT(Ser473) reveló un circuito de retroalimentación negativa entre las rutas de señalización MAPK y PI3K/AKT. Los ensayos de proliferación celular y el análisis cuantitativo del tamaño celular revelaron fenotipos consistentes con el grado de desregulación de MAPK, proporcionando biomarcadores fenotípicos adicionales para diferenciar entre variantes patogénicas y benignas en ambos genes. La relevancia tisular de HEK293T (contextos epiteliales/neuroectodérmicos) y NIH3T3 (mesenquimales) permitió reproducir la heterogeneidad clínica observada en pacientes. Los resultados de esta tesis doctoral han permitido reclasificar variantes de significado incierto en ambos genes e identificar la hiperactivación de ERK como diana terapéutica prioritaria, apoyando el uso de inhibidores de MEK en contextos compatibles con esta desregulación. En conjunto, este trabajo establece un marco integral para la interpretación funcional de variantes en RASopatías y para el desarrollo de futuras estrategias de medicina personalizada.; [EN] RASopathies associated with alterations in the NF1 and SPRED1 genes exhibit marked clinical and molecular heterogeneity, where the main challenge after genetic diagnosis lies in the functional interpretation of the identified variants. To address this issue, this doctoral thesis established a multidisciplinary experimental workflow that integrates the analysis of NF1 and SPRED1 variants reported in public databases and in patients from the DIERCyL cohort, together with in silico structural and protein-stability modeling, cellular signaling assays, proliferation studies, and morphometric analyses in HEK293T and NIH3T3 cell lines. Database analyses identified critical structural hotspots in neurofibromin (CSRD, GRD, and Armadillo1), whereas SPRED1 variants showed a more homogeneous distribution, suggesting distinct pathogenic mechanisms. In patient-derived NF1 and SPRED1 variants, energy-based analyses revealed a continuous spectrum in neurofibromin, ranging from haploinsufficiency to dominant-negative effects in late truncating variants, while SPRED1 alterations predominantly showed loss-of-function behavior. The in vitro cellular assays revealed distinct signaling dynamics depending on the type of variant analyzed in NF1 and SPRED1. Notably, ERK hyperactivation emerged as the most determinant molecular event for pathogenicity. Co-activation of p38 identified variants associated with more severe clinical outcomes, whereas the inverse p-ERK/p- AKT(Ser473) relationship revealed a negative feedback circuit between the MAPK and PI3K/AKT pathways. Cell-proliferation assays and quantitative cell-size analyses uncovered phenotypes consistent with the degree of MAPK deregulation, providing additional phenotypic biomarkers to discriminate between pathogenic and benign variants in both genes. The tissue relevance of HEK293T (epithelial/neuroectodermal contexts) and NIH3T3 (mesenchymal) cells allowed us to recapitulate the clinical heterogeneity observed in patients. The results of this doctoral thesis enabled the reclassification of variants of uncertain significance in both genes and identified ERK hyperactivation as a priority therapeutic target, supporting the use of MEK inhibitors in contexts consistent with this dysregulation. Taken together, this work establishes a comprehensive framework for the functional interpretation of variants in RASopathies and for the development of future personalizedmedicine strategies.

Análisis de la interacción entre la bacteria promotora de crecimiento vegetal Pseudomonas sp. CDVBN 10-B y cultivos de interés agrícola

Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT

[ES] El uso indiscriminado de fertilizantes y pesticidas químicos en los sistemas agrícolas ha provocado una degradación progresiva de la calidad del suelo, alteraciones en la estructura y funcionalidad de las comunidades microbianas, así como la contaminación de otros ecosistemas. Frente a esta problemática ambiental, las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB) se presentan como una alternativa biotecnológica sostenible, con el potencial de mantener o incluso mejorar el rendimiento de los cultivos sin comprometer la salud del ecosistema. El potencial de las PGPB se basa en diversos mecanismos, entre los que se destacan la colonización eficiente de tejidos vegetales en uno o varios hospedadores, la capacidad de facilitar la disponibilidad de nutrientes esenciales y la modulación de los niveles hormonales en las plantas. A través de estos mecanismos, dichas bacterias pueden influir de manera determinante en procesos fisiológicos clave, tales como la modificación de la arquitectura del sistema radicular, lo que favorece la adaptación del hospedador a su entorno, potencia interacciones sinérgicas con otros microorganismos beneficiosos y promueve una mayor resistencia frente a condiciones adversas como sequía o la salinidad. Las cepas bacterianas que presentan estas características se consideran candidatas para el desarrollo de bioinoculantes, susceptibles de ser formulados, producidos a escala industrial, distribuidos y aplicados en sistemas agrícolas. No obstante, los buenos resultados de estos bioinoculantes in vitro no garantizan la efectividad del producto bajo condiciones reales. Por tanto, durante el proceso de formulación es indispensable evaluar aspectos críticos como la estabilidad del producto, su vida útil y, fundamentalmente, su eficacia bajo condiciones no controladas. En este contexto, la cepa Pseudomonas sp. CDVBN10, endófito de raíces de colza, ha demostrado tener potencial como PGPB. Análisis genómicos y bioquímicos han evidenciado su capacidad para producir sideróforos, solubilizar fosfatos, sintetizar ácido indol-3-acético (AIA), presentar actividad ACC desaminasa y formar biofilm en la superficie radicular. Ensayos funcionales adicionales confirmaron su eficacia para promover el crecimiento de colza y cultivos hortícolas como espinaca y cilantro (Jiménez-Gómez, 2020; Jiménez-Gómez et al., 2020). La cepa CDVBN10-B deriva de la cepa CDVBN10, pero cuenta con una deleción genómica de origen desconocido que fue descubierta tras finalizar la presente tesis doctoral. No obstante, nuestros estudios han demostrado que esta cepa sigue manifestando las citadas propiedades. El objetivo general de la presente tesis doctoral es profundizar en la caracterización funcional de la cepa Pseudomonas sp. CDVBN10-B como un bioinoculante de amplio espectro. Para ello, se plantea la caracterización exhaustiva de su potencial como PGPB en cultivos de interés agronómico, la evaluación de los mecanismos moleculares implicados en su interacción con la planta, la remodelación de la arquitectura radicular y la inducción de resistencia sistémica, así como el diseño de un bioinoculante efectivo para su aplicación en condiciones de campo.; [EN] The indiscriminate use of chemical fertilizers and pesticides in agricultural systems has led to progressive soil degradation, disruptions in the structure and functionality of microbial communities, and contamination of surrounding ecosystems. In response to this environmental challenge, plant growth-promoting bacteria (PGPB) have emerged as a sustainable biotechnological alternative with the potential to maintain or even enhance crop yields without compromising ecosystem health. The potential of PGPB relies on several mechanisms, including efficient colonization of plant tissues in one or more hosts, enhanced availability of essential nutrients, and modulation of plant hormone levels. Through these mechanisms, PGPB can significantly influence key physiological processes such as the modification of root system architecture, thereby improving host adaptation to environmental conditions, facilitating synergistic interactions with other beneficial microorganisms, and enhancing tolerance to abiotic stresses such as drought and salinity. Bacterial strains exhibiting these traits are considered suitable candidates for the development of bioinoculants that can be formulated, produced at an industrial scale, distributed, and applied in agricultural systems. However, successful in vitro performance does not necessarily guarantee product effectiveness under field conditions. Thus, formulation development must include the assessment of critical factors such as product stability, shelf life, and, above all, efficacy under non-controlled environments. In this context, Pseudomonas sp. CDVBN10, an endophyte isolated from rapeseed roots, has demonstrated potential as PGPB. Genomic and biochemical analyses revealed its ability to produce siderophores, solubilize phosphate, synthesize indole-3-acetic acid (IAA), exhibit ACC deaminase activity, and form biofilms on root surfaces. Additional functional assays confirmed its capacity to promote the growth of rapeseed and horticultural crops such as spinach and coriander (Jiménez-Gómez, 2020; Jiménez-Gómez et al., 2020). CDVBN10-B, a derivative of strain CDVBN10, was later found to harbor a genomic deletion of unknown origin, identified upon completion of this doctoral thesis. Nevertheless, our studies have shown that this strain retains the aforementioned properties. The overall objective of this doctoral thesis is to conduct an in-depth functional characterization of Pseudomonas sp. CDVBN10-B as a broad-spectrum bioinoculant. This includes a comprehensive evaluation of its potential as PGPB in crops of agronomic interest, investigation of the molecular mechanisms involved in its interaction with host plants, its role in remodeling root architecture and inducing systemic resistance, and the development of an effective bioinoculant suitable for field application.

Análisis evolutivo y funcnioal de los efectores nucleares CgEP1 y CgEP4 de Colletotrichum graminicola, agente causal de la antracnosis del maíz

Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT

[ES] Colletotrichum es un género de hongos filamentosos fitopatógenos que causan la enfermedad de la antracnosis. Colletotrichum graminicola es el agente causal de la antracnosis del maíz (Zea mays), una enfermedad de gran impacto económico cuya incidencia está en aumento en distintas regiones del mundo y cuyos principales síntomas son el tizón foliar y la pudrición del tallo. Su éxito infeccioso depende en gran medida de la acción de proteínas efectoras, muchas de las cuales permanecen poco caracterizadas. Esta Tesis Doctoral se centró en dos efectores nucleares clave que son parálogos entre sí: CgEP4 y CgEP1 (Colletorichum graminicola Effector Protein 4 and 1). El estudio de CgEP4 reveló que se trata de un efector con localización nuclear altamente conservado, originado por una duplicación ancestral, cuya función resulta indispensable para la virulencia. Este gen está altamente conservado entre aislados de campo de C. graminicola de distintos continentes, lo que subraya su importancia biológica. A nivel experimental, se comprobó que CgEP4 se expresa de manera específica durante las fases iniciales de la infección y se transloca al núcleo de las células de maíz. Los mutantes de deleción mostraron una notable reducción en la capacidad de penetración y colonización, así como una activación fuerte de defensas basales en el hospedador, lo que indica que este efector cumple un papel esencial en la supresión de respuestas inmunitarias tempranas. Además, los ensayos in vitro revelaron que su ausencia altera procesos fúngicos fundamentales como el crecimiento, la esporulación y la tolerancia al estrés oxidativo y salino, lo que apunta a una doble función de CgEP4: actuar sobre el hospedador y, al mismo tiempo, regular aspectos internos de la fisiología del hongo. El análisis de CgEP1 se centró en la influencia de las repeticiones en tándem que presenta en su secuencia sobre la virulencia. A partir de un conjunto de aislados naturales se identificaron variantes alélicas que diferían en el número de repeticiones intragénicas (entre 5 y 8), lo que permitió establecer una relación directa entre la arquitectura del gen y la virulencia. Experimentos de complementación funcional demostraron que se requieren al menos siete repeticiones para mantener la virulencia, mientras que alelos con menos repeticiones pierden eficacia infecciosa y se comportan como mutantes nulos. Modelados estructurales realizados con AlphaFold2 confirmaron que la pérdida de repeticiones compromete la estabilidad tridimensional de la proteína, explicando la pérdida de función. A nivel transcriptómico, se comprobó que CgEP1 no solo suprime genes de defensa en las primeras etapas de la infección, sino que también reprograma el metabolismo del maíz en fases posteriores, favoreciendo la colonización. De forma paralela, en el propio hongo regula la expresión de genes asociados a la biosíntesis proteica, al metabolismo energético y a enzimas de degradación de la pared vegetal, reforzando su papel como efector multifuncional capaz de coordinar tanto la respuesta del hospedador como la del patógeno. En conjunto, esta tesis doctoral demuestra que CgEP4 y CgEP1 son efectores nucleares fundamentales para la virulencia de C. graminicola. Ambos casos ilustran la complejidad de las interacciones planta-patógeno y aportan nuevas perspectivas para el diseño de estrategias de control frente a la antracnosis del maíz.

Estudio "ómico" integrado de Agaricus bisporus: estructura de las comunidades microbianas, perfiles bacterianos asociados a enfermedad y respuestas transcripcionales en la interacción hospedador-patógeno

Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT

[ES] El estudio de los hongos y, en particular, de Agaricus bisporus (champiñón de París o champiñón blanco), ha acompañado a la humanidad desde tiempos prehistóricos, atravesando usos rituales, medicinales, culinarios y, en la actualidad, industriales. Esta especie, por su valor nutricional, económico y biotecnológico, es uno de los pilares del cultivo mundial de hongos. El champiñón, es un hongo basidiomiceto ampliamente cultivado y consumido a nivel mundial. Representa una etapa transitoria (el cuerpo fructífero o esporocarpo) de un organismo cuyo ciclo de vida se desarrolla mayormente como una red de filamentos (micelio) que coloniza sustratos orgánicos compostados. Morfológicamente, presenta un sombrero (píleo), láminas (donde se producen las esporas) y un pie (estípite). Es un descomponedor secundario saprofito, especializado en degradar sustratos ricos en lignina y celulosa. El champiñón es un alimento de bajo contenido calórico y rico en proteínas, vitaminas y minerales, con un impacto económico global significativo en la agricultura. Sin embargo, la industria del champiñón se enfrenta a desafíos importantes, como la dependencia en la turba (un recurso no sostenible) como tierra de cobertura, la amenaza constante de enfermedades fúngicas devastadoras como la mole seca (Lecanicillium fungicola), la mole húmeda (Mycogone perniciosa) y la tela de araña (Cladobotryum mycophilum), y un número cada vez más limitado de fungicidas eficaces y permitidos. Además, existe una falta de conocimiento profundo sobre las interacciones hongo (huésped)-hongo (patógeno) a nivel molecular que hace más difícil el desarrollo de nuevas estrategias de control. En este contexto se desarrolla esta tesis, que busca profundizar en la comprensión de la ecología microbiana y las interacciones moleculares subyacentes al cultivo de A. bisporus y su susceptibilidad a las principales enfermedades fúngicas. Al investigar la dinámica de las comunidades microbianas en la cobertura, el impacto de los fungicidas, los cambios en el bacterioma durante la enfermedad y los perfiles transcriptómicos de huésped y patógeno, se busca proporcionar una base científica para desarrollar prácticas de producción mejores, más sostenibles y estrategias de control de enfermedades más efectivas. El capítulo 1 se centra en caracterizar mediante secuenciación de nueva generación (NGS), la estructura de la microbiota (bacteriana y fúngica) de la tierra de cobertura, a base de turba, utilizada en el cultivo de A. bisporus, y cómo esta evoluciona durante la incubación del hongo, así como el efecto de los tratamientos fungicidas clorotalonil y metrafenona. Se observaron cambios estadísticamente significativos en las poblaciones de bacterias y hongos. La composición microbiana se modificó significativamente según el día de incubación, cambiando radicalmente desde las comunidades originales en la materia prima, a una composición microbiana específica impulsada por el crecimiento del micelio de A. bisporus. Los filos bacterianos más dominantes fueron Proteobacteria y Bacteroidota. Se observó un gran cambio en la estructura de las poblaciones bacterianas entre el día 0 y los días siguientes. Las poblaciones de hongos cambiaron más gradualmente, con A. bisporus (familia Agaricaceae, filo Basidiomycota) desplazando al resto de las especies (mayoritariamente del filo Ascomycota inicialmente) a medida que 19 avanzaba el ciclo de cultivo. El tratamiento con clorotalonil, retrasó la colonización de la cobertura por A. bisporus, justificado por una menor proporción de la familia Agaricaceae en las muestras tratadas con este fungicida en comparación con el control y el tratamiento con metrafenona, especialmente en el día 7. Aunque no hubo diferencias significativas en la alfa diversidad entre las comunidades bacterianas entre tratamientos en el día 7, la beta diversidad entre las comunidades fúngicas sí mostró diferencias significativas, sugiriendo un impacto de los fungicidas en la composición general de la comunidad fúngica. Las limitaciones en las bases de datos taxonómicas actuales a menudo no permiten alcanzar una identificación taxonómica a nivel de especie en la mayoría de los casos, lo que restringe la profundidad del análisis.; [EN] The study of fungi, in particular Agaricus bisporus (white button mushroom), has accompanied humanity since prehistoric times, through ritual, medicinal, culinary and, nowadays, industrial uses. This species, due to its nutritional, economic and biotechnological value, is one of the pillars of global mushroom cultivation. The white button mushroom is a basidiomycete fungus that is widely cultivated and consumed worldwide. It represents a transitional stage (the fruiting body or sporocarp) of an organism whose life cycle develops mainly as a network of filaments (mycelium) that colonises composted organic substrates. Morphologically, it has a cap (pileus), gills (where the spores are produced) and a stem (stipe). It is a secondary saprophytic decomposer, specialised in degrading lignin and cellulose rich substrates. Mushrooms are a low-calorie food rich in protein, vitamins and minerals, with a significant global economic impact on agriculture. However, the mushroom industry faces significant challenges, such as dependence on peat (a non-sustainable resource) as casing soil, the constant threat of devastating fungal diseases such as dry bubble (Lecanicillium fungicola), wet bubble (Mycogone perniciosa) and cobweb (Cladobotryum mycophilum), and an increasingly limited number of effective and permitted fungicides. In addition, there is a lack of knowledge about fungus (host)-fungus (pathogen) interactions at the molecular level, which makes it more difficult to develop new control strategies. This thesis was developed in this context and seeks to deepen the understanding of the microbial ecology and molecular interactions underlying the cultivation of A. bisporus and its susceptibility to major fungal diseases. By investigating the dynamics of microbial communities in the casing soil, the impact of fungicides, changes in the bacteriome during disease, and the transcriptomic profiles of host and pathogen, we seek to provide a scientific basis for developing better, more sustainable production practices and more effective disease control strategies. Chapter 1 focuses on characterising, through next-generation sequencing (NGS), the structure of the microbiota (bacterial and fungal) of the peat-based casing soil used in the cultivation of A. bisporus, and how it evolves during the incubation of the fungus, as well as the effect of the fungicide treatments chlorothalonil and metrafenone. Statistically significant changes in bacterial and fungal populations were observed. The microbial composition changed significantly depending on the day of incubation, changing radically from the original communities in the raw material to a specific microbial composition driven by the growth of A. bisporus mycelium. The most dominant bacterial phyla were Proteobacteria and Bacteroidota. A major change in the structure of bacterial populations was observed between day 0 and the following days. Fungal populations changed more gradually, with A. bisporus (family Agaricaceae, phylum Basidiomycota) displacing the rest of the species (initially mainly from the phylum Ascomycota) as the cultivation cycle progressed. Treatment with chlorothalonil delayed the colonisation of the casing soil by A. bisporus, justified by a lower proportion of the Agaricaceae family in the samples treated with this fungicide compared to the control and treatment with metrafenone, especially on day 7. Although there were no significant differences in alpha diversity between bacterial communities between treatments on day 7, beta diversity between fungal communities did show significant differences, suggesting an impact of fungicides on the overall composition of the fungal community. Limitations in current taxonomic databases often do not allow taxonomic identification at the species level in most cases, which restricts the depth of the analysis.

El exómero coordina la señalización celular con la homeostasis iónica y lipídica

Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT

[ES] El exómero es un complejo proteico tradicionalmente relacionado con el transporte de proteínas transmembrana desde el TGN hasta la MP. Sin embargo, algunos resultados sugieren que podría tener funciones adicionales. Algunos fenotipos de los mutantes del exómero, como alteraciones en la polaridad o sensibilidad a iones e higromicina, no se han podido adscribir a la retención en el Golgi de ninguna proteína transmembrana implicada en esos procesos (Anton et al., 2017; Hoya et al., 2017; Trautwein et al., 2006). En el caso de S. pombe no se ha encontrado ninguna proteína transmembrana, implicada en ninguno de los procesos estudiados, que se quede retenida en el TGN o se deslocalice en ausencia del exómero (Hoya et al., 2017). Esto potencia la idea de que en este organismo el exómero no es un adaptador de cargo clásico. Además, el hecho de que coopere tanto con AP-1 en el tráfico anterógrado a la MP, como con los GGAs en el tráfico hacia el PVE (Hoya, 2017) sugiere que podría participar en un proceso más general del tráfico vesicular que lo que correspondería a un adaptador específico de cargo. Esta cooperación también se ha descrito en S. cerevisiae (Anton-Plagaro et al., 2021), lo que sugiere que en la levadura de gemación el exómero podría tener una función de adaptador (la más caracterizada) y otra función más general. El hecho de que los mutantes carentes del exómero (cfr1Δ y bch1Δ) tengan varios fenotipos, aparentemente no relacionados, pero que ninguno de ellos sea muy penetrante apoya la idea de que el exómero de S. pombe pueda participar en algún proceso general, que afecte a varias funciones biológicas sin ser esencial para ninguna de ellas. Además, también estaría de acuerdo con el hecho de que en rastreos de 2-híbridos realizados usando Cfr1 o Bch1, prácticamente sólo se obtenga con el otro componente del exómero (nuestros resultados, y (Vo et al., 2016), y en rastreos tipo SGA o de proteómica no se hayan encontrado, de manera reproducible, genes/proteínas que participen en un proceso determinado. En resultados anteriores del laboratorio los mutantes del exómero de S. pombe presentaron defectos leves en: fusión celular durante la conjugación, tráfico de la carboxipeptidasa Y, composición de la pared celular, crecimiento en presencia de caspofungina, tunicamicina, DTT, higromicina, y algunas sales, y septación en presencia de KCl y sorbitol (Cartagena-Lirola et al., 2006; Hoya, 2016; Hoya et al., 2017; Moro, 2018; Moro et al., 2021). De entre la sensibilidad a sales, cabe destacar sensibilidad a CaCl2 y a sales de K+. En particular los mutantes son sensibles a KCl 0,6 M, KNO3 0,6 M y acetato de potasio 0,02 M. Sin embargo, los mutantes crecen bien en presencia de sorbitol 1,2 M, un medio con una osmolaridad similar a la de KCl 0,6 M (Moro et al., 2021), lo que indica que la ausencia del exómero provoca sensibilidad a estrés iónico pero no a estrés osmótico. Además, el sorbitol no mejora el crecimiento en presencia de KCl, y las células mutantes son capaces de recuperar su crecimiento normal al pasar de medio con KCl a medio sin KCl. Esto indica que la sensibilidad a KCl no es consecuencia de la lisis celular provocada por las alteraciones en la pared celular del mutante (Hoya et al., 2017; Moro et al., 2021). Además, los resultados iniciales obtenidos en el laboratorio indicaron que la ausencia del exómero provoca una activación anómala de la ruta de integridad celular. Un análisis inicial de la localización de Rgf1, una GEF de Rho1 y componente de la ruta de integridad, indicó que esta proteína se localiza en la superficie celular en las cepas WT y cfr1Δ, se deslocaliza tras 15 minutos de tratamiento con KCl y vuelve a recuperar su localización en la superficie celular en una cepa WT, pero es incapaz de hacerlo en la cepa mutante del exómero (Moro, 2018). También se vio que en condiciones de estrés iónico el sistema endosomal de las células mutantes del exómero tiene una morfología alterada, lo cual podría contribuir a los diversos fenotipos leves relacionados con el transporte vesicular y la homeostasis iónica que presentan estas células (Moro et al., 2021).

Análisis del endobacterioma asociado a Rubus ulmifolius Schott, evaluación del potencial antifúngico del volatiloma bacteriano vinculado y estudio de la influencia de cepas de los géneros Arthrobacter y Rhizobium en la variación de la expresión génica relacionada con la tolerancia al estrés oxidativo en el modelo in vivo Caenorhabditis elegans

Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT

[ES]La población humana está en constante crecimiento y, a partir de la Revolución Industrial, experimentó un incremento exponencial descontrolado. La agricultura es la base de la alimentación humana y, para satisfacer la continua demanda de alimentos, ha tenido que evolucionar y mejorar para conseguir cultivos más eficientes. Los fertilizantes y pesticidas químicos son dos de los factores más importantes en la agricultura que aportan los nutrientes necesarios a los cultivos y los protegen de las enfermedades. El uso de los fertilizantes y de los pesticidas ha ido en aumento desde su incorporación a la agricultura. Entre el año 2000 y el 2021, el consumo mundial de fertilizantes aumentó en un 144,3%, mientras que el consumo de los pesticidas aumentó en un 162,3%. En la actualidad, se han descrito una serie de consecuencias negativas relacionadas con la salud ambiental y la humana, derivadas del uso excesivo de los compuestos agroquímicos. El exceso de estos productos que no son absorbidos por las plantas, son acumulados en los suelos. Estos, ya sea por la lluvia, la erosión del suelo, el riego o la infiltración, acaban en las aguas subterráneas y los acuíferos, lo que altera las características fisicoquímicas del agua y la contamina. Además, el uso excesivo de los pesticidas químicos ha dado lugar a la aparición de cepas de microorganismos fitopatógenos resistentes a estos compuestos, los cuales acaban perdiendo su efectividad y capacidad de control. Por esta razón, en los últimos años, las diferentes legislaciones gubernamentales y supragubernamentales se han vuelto más estrictas con respecto al uso de este tipo de compuestos químicos, por lo que es necesaria la búsqueda de alternativas más sostenibles. Una de las alternativas propuestas es el uso de bioestimulantes o biopesticidas. Por un lado, los bioestimulantes son compuestos formulados en base a microorganismos PGP (Plant Growth Promotion) que poseen diferentes mecanismos de acción que inducen el crecimiento vegetal. Por otro lado, los biopesticidas son formulados en base a microorganismos que poseen actividad antagonista frente a algún fitopatógeno, ya sea porque lo combaten o porque previenen la infección. La mayoría de estos microorganismos con interés agronómico utilizados para estos fines provienen o bien de los suelos, ya que están relacionados con la fertilidad y la productividad del suelo; o bien del interior de los tejidos vegetales, pues son organismos capaces de establecer relaciones ás estrechas con las plantas que los microorganismos edáficos. En este sentido, tanto los microorganismos edáficos como los que habitan en el interior de las plantas, llamados endófitos, pueden tener un rol activo en el mantenimiento de los sistemas agrícolas. El estudio de estos microorganismos y de sus interacciones con las plantas puede abrir nuevas puertas al desarrollo de nuevos bioestimulantes o biopesticidas. Los microorganismos del suelo desempeñan funciones que son esenciales para el mantenimiento de los ecosistemas. Además, inducen el crecimiento de las plantas y mejoran la salud vegetal, por lo que son considerados como un importante recurso para el mantenimiento de la sostenibilidad en los sistemas agrícola. La interacción entre las plantas y los microorganismos del suelo no es unidireccional, ya que las plantas también influyen en la microbiota edáfica. En este sentido, diversos estudios apoyan la teoría de que las plantas reclutan a microorganismos específicos mediante la liberación de exudados, que las ayudan en la adquisición de nutrientes y la mitigación de estreses tanto bióticos como abióticos. Estos microorganismos pueden colonizar los tejidos de la planta y establecerse en su interior, pasando a ser considerados microorganismos endófitos, los cuales ahora conforman el microbioma de la planta. Este conjunto de microorganismos está involucrado en el mantenimiento del estado de la salud y la nutrición óptima de la planta. El origen de los microorganismos que interaccionan con las plantas es diverso. La mayoría son reclutados a partir del suelo circundante, y conforman la microbiota rizosférica de la planta, mientras que otros provienen del ambiente aéreo y tienen una influencia determinante sobre la microbiota filosférica, en la superficie de los tejidos vegetales. Tanto los microorganismos que conforman la rizosfera como los que conforman la filosfera pueden acabar colonizando el interior de las plantas y así establecerse en la endosfera. Para ello, deben de atravesar y de penetrar los tejidos vegetales. Las estimaciones indican que el suelo rizosférico es el contribuyente mayoritario de la microbiota endófita de las plantas,contribuyendo con más de dos tercios de la diversidad bacteriana y la fúngica. Además, la composición de los ambientes endofíticos es diversa, variando no solo entre las plantas sino también entre los compartimentos de un mismo individuo. Dado que estos microorganismos están intrínsecamente ligados a la planta, es probable que muchos de ellos posean mecanismos beneficiosos para las plantas. Sin embargo, muchas de estas funciones siguen sin estar caracterizadas. Las nuevas técnicas de secuenciación masiva evitan algunas de las limitaciones asociadas al cultivo de microorganismos ya que permiten analizar toda la comunidad, incluidas las células que están inactivas. Estos microorganismos pueden contar con diferentes mecanismos que sirvan para el desarrollo de bioestimulantes o biopesticidas. Por un lado, los bioestimulantes cuentan con mecanismos de promoción del crecimiento vegetal, que facilitan la adquisición de nutrientes como el nitrógeno, el fósforo, el potasio o el hierro o intervienen en la regulación hormonal de la planta. Por otro lado, los biopesticidas cuentan con mecanismos de protección frente a patógenos, como la producción de moléculas antibióticas o la inducción de la resistencia sistémica en la planta.

Selección de bacterias bioestimulantes para trigo duro y maíz común, y búsqueda de nuevos agentes de biocontrol frente a fitopatógenos mediante el análisis del bacterioma del escarabajo de la corteza del abeto europeo (lps typographus)

Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT

[EN]World population is growing at an unprecedented rate, reaching 8 billion people in 2023 and projected to surpass 9 billion by 2050. This situation implies an increasing number of resources needed to meet humanity's demand for food and other necessities, intensifying human impacts on natural ecosystems. In this context, wheat and maize play a crucial role in human nutrition as they are two major crops worldwide, accounting for 28% of the global agricultural yield. However, current agricultural practices heavily rely on inorganic fertilizers and pesticides to achieve high yields. This causes significant environmental degradation. Inorganic fertilizers production is largely based on fossil fuels, contributing to greenhouse gas emissions and local acidification. Moreover, the overuse of these products degrades soil quality and leads to nutrient accumulation in freshwater systems, causing eutrophication. On the other side, phytopathogens, if not treated, are predicted to reduce cereal yield in around 32%, mostly because of fungi-caused diseases. Chemical pesticides are non-specific, persistent in the environment, and can lead to the development of resistances, reducing their effectiveness. This situation necessitates a paradigm shift in agriculture to address these issues, leading to the development of more sustainable practices. Bacterial inoculants based on plant-growth promoting bacteria (PGPB) can benefit plant development and provide protection against pests and diseases. PGPB action mechanisms enhance nutrient availability, stimulate plant growth, induce plant resistances to biotic and abiotic stresses, and provide protection against phytopathogens by competition and/or antagonism. PGPB based biostimulants have the potential to increase crop yields and quality without relying on chemical additives or, at least, reducing the dependence on them. Similarly, bacterial biocontrol agents (BBCA) based on PGPB can protect plants against phytopathogens meanwhile reducing the use of chemical pesticides. Recent studies revealed that insects might harbour more bacterial strains with strong antagonistic capacities against microbial pathogens than other niches, such as soil or plants. The Ips typographus bark beetle ecological context and previous studies suggest that bacterial associates to this beetle may have biocontrol potential against pathogenic fungi, representing an almost unexplored niche for obtaining strains with BBCA capacities. In this thesis, different laboratory, field, and computational techniques were used to search for bacterial inoculants of interest for wheat and maize plants, promoting their growth and protecting them against phytopathogens. The work has been divided in two sections: Section I includes the work carried out in the search for bacteria with biostimulant potential for durum wheat and common corn. Meanwhile, Section II focused on the search for BBCA of interest for forestry and crops management, with special interest in durum wheat, in a novel niche for BBCA, the Ips typographus bark beetle.

Análisis comparativo de reordenamientos estructurales y de repeticiones intragénicas entre proteínas efectoras en el género patogénico de plantas Colletotrichum

Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT

[ES] El género Colletotrichum de destaca entre los hongos filamentosos más importantes a nivel mundial, está comprendido por numerosas especies que en su mayoría son patógenos de plantas, los cuales puede tener un impacto significaivo en la agricultura. Afecta principalmente a especies dicoiledóneas como fresas, manzanas y cítricos, pero también infecta a monocoiledóneas como maíz y sorgo. Este género es conocido por causar antracnosis, una enfermedad que produce lesiones necróicas en tallos, hojas y frutos, generando pérdidas económicas sustanciales. Por su parte, la especie Colletotrichum graminicola es un patógeno de gran importancia en culivos de maíz, causando la enfermedad conocida como antracnosis del maíz, que puede resultar en pérdidas totales del culivo. Los síntomas incluyen lesiones necróicas y pudrición del tallo, afectando considerablemente el rendimiento. El culivo maíz (Zea mays) es de relevancia mundial, y hoy día sigue siendo el segundo cereal más culivado. La mancha foliar y la pudrición del tallo producida por C. graminicola puede infectar todas las partes de la planta y estar presente durante todo el crecimiento. La expansión geográfica de C. graminicola en Europa, reportada recientemente en España, destaca la necesidad de coninuar invesigando y monitoreando esta enfermedad para prevenir futuras epidemias y proteger principalmente la producción de maíz y en general la seguridad alimentaria. [EN] Colletotrichum, a member of the division Ascomycota, represents one of the largest phyla of fungi (Damm et al., 2009). Many species are plant pathogens and have a significant impact on agriculture, affecing a wide range of hosts (Cannon et al., 2012). Some species are host specific, while others can affect more than one plant species (O’Connell et al., 2012; Baroncelli et al., 2017; Talhinhas and Baroncelli, 2021). The Colletotrichum genus primarily affects dicotyledonous species, including strawberry, apple, citrus, and stone fruits, making up more than 77% of all documented plant pathogens. Around 20% of the species in the genus affect monocotyledonous plants like maize and sorghum, showing a disinct host preference. This divergence is paricularly pronounced within specific clades such as the bambusicola, spaethianum, ibetense, and graminicola/caudatum species complexes, which predominantly infect monocots (Talhinhas and Baroncelli, 2023). Numerous species have been described since the first report of Colletotrichum (Corda, 1831). From constant taxonomic revisions, about 340 species of Colletotrichum have been idenified and organized into 20 phylogeneic lineages known as species complexes (Figure 1) (Talhinhas and Baroncelli, 2021; Talhinhas and Baroncelli, 2023). This genus is classified by plant pathologists as being among the top ten most destrucive genera of pathogenic fungi (Dean et al., 2012), capable of causing total crop failures and significant economic losses (Prusky et al., 2000; Baroncelli et al., 2017; Dowling et al., 2020).

Biocontrol de microorganismos que alteran el vino

Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT

[ES] El vino ha sido una parte integral de la civilización humana durante miles de años, y los primeros signos de actividades vitivinícolas a gran escala se remontan al menos al 5000 a.C. Durante los milenios siguientes, se aplicaron estrategias de mejoramiento tradicional y selección a los precursores silvestres de las vides modernas para proporcionarnos la variedad de cultivares de Vitis vinifera que se utilizan hoy en día en la producción de vino. Sin embargo, no fue hasta los siglos XIX y XX cuando se comenzaron a clasificar formalmente los microorganismos que eran responsables de la conversión del mosto de uva en vino (Fig. 1). Finalmente se identificó a la levadura Saccharomyces cerevisiae como el principal microorganismo responsable de la producción de vino, y se demostró que la bacteria Oenococcus oeni es responsable de la fermentación maloláctica, una fermentación secundaria que tiene lugar en muchos vinos (Borneman et al., 2013).

Caracterización del volatiloma y efecto de la inoculación de cepas de los géneros Pseudomonas, Priestia y Rhizobium en la variación de la expresión génica referida a la mitigación del estrés salino vegetal y análisis de la influencia de los compuestos fenólicos en el sistema modelo in vivo Caenorhabditis elegans

Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT

[ES] El objetivo general de la presente tesis doctoral es el desarrollo de bioinoculantes bacterianos multifuncionales, obtenidos mediante el aislamiento y la caracterización de bacterias rizosféricas y endófitas de especies vegetales, y el análisis funcional y molecular de su capacidad para mitigar los efectos dañinos del estrés salino y de mejorar las propiedades nutricionales de cultivos hortícolas de interés agroalimentario.

Impacto de la Farmacogenética en la Medicina Personalizada de Precisión aplicada a la Prescripción Terapéutica

Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT

[ES] La seguridad del paciente en la prescripción farmacológica es un objetivo primordial en la asistencia sanitaria y está directamente relacionada con la respuesta individual al tratamiento. Dicha respuesta está condicionada en gran medida por los factores genéticos. En este sentido, la Farmacogenética se basa en el estudio de las variantes génicas que influyen en la respuesta individual a los fármacos. Surge así la Medicina Personalizada de Precisión, como un nuevo enfoque respecto a la Medicina Clásica, centrado en el paciente de forma individual. En este trabajo nos proponemos estudiar las características específicas de los pacientes a los que se les ha realizado el estudio farmacogenético para el ajuste racionalizado de la medicación. Para ello nos planteamos analizar las características clínico-biológicas, la prescripción farmacológica y el perfil farmacogenético de los pacientes para finalmente evaluar la relevancia clínica de los resultados obtenidos. Así mismo, hemos realizado una aproximación del estudio de variantes estructurales de CYP2D6 y una comparación de los resultados obtenidos por medio de dos estrategias de genotipado. Además, la información disponible en la actualidad sobre recomendaciones internacionales se emite en relación con los fármacos individuales, y, sin embargo, los pacientes se presentan en su mayoría en un contexto de politerapia. Por todo ello, el estudio se ha realizado mediante la aplicación de un modelo propio denominado 5SPM de Medicina de Precisión, en 5 pasos, utilizando el genotipado de marcadores mediante técnicas de Biología Molecular y el posterior análisis in silico de los datos. Un modelo internacionalmente innovador que enfoca el ajuste terapéutico considerando el contexto de la polimedicación. En este trabajo hemos obtenido varios resultados con relevancia clínica en relación con distintos marcadores como CYP2C9, CYP3A5 y CYP2D6 y hemos identificado la presencia de un porcentaje importante de pacientes portadores de genotipos asociados a disminución de la actividad enzimática de alguno de los marcadores estudiados, lo que pone de manifiesto la enorme importancia de realizar estudios farmacogenéticos actualizados, en especial en aquellos pacientes polimedicados. [EN] One of the main objectives in health care is patient safety in pharmacological prescription, which directly correlates to the individual treatment response. Genetic factors largely condition this response. In this way, Pharmacogenetics is based on the study of genetic variants that influence the individual response to drugs. Thus, arises Personalized Precision Medicine as a new approach to Classical Medicine, focused on the patient’s individuality. In this study we will try to study the specific characteristics of the patients treated using a pharmacogenetic study for the rational adjustment of the medication. In order to do so, we propose to analyze the biological-clinical characteristics, the pharmacological prescription and the pharmacogenetic profile of the patients, finally evaluating the clinical relevance of the results that have been obtained. Likewise, we have carried out an approach to studying structural variations of CYP2D6 and comparing the results obtained through different types of genotyping. In addition, the available international information in mainly related to individual drugs, however, in actual life, patients are under polypharmacy. Considering that, this study carried out applying 5SPM of Precision Medicine in 5 steps, an own model, using the pharmacogenotyping techniques and the subsequent in silico data analysis. This is an internatonial innovative model owing to the fact that it takes into account the complete context of patient therapy. In this work, we have obtained results with clinical relevance related to different markers such as CYP2C9, CYP3A5, and CYP2D6, and we have identified a significant amount of patients that have genotypes associated with a decrease in the enzymatic activity of some of the studied markers, which shows the enormous importance of doing innovative pharmacogenetic studies, especially in polymedicated patients.

La interacción de Micromonospora con su planta huésped y el microbioma circundante

Sat, 01 Jul 2023 00:00:00 GMT

[ES] La Unión Europea depende en gran medida de las importaciones de soja (> 70%) como fuente de proteínas, ya que la producción local apenas cubre el 5% de la demanda interna. Por ello, es necesario explorar fuentes alternativas para reducir esta dependencia. Entre las leguminosas, Lupinus angustifolius es una opción dado su alto valor proteico y su uso para la alimentación animal y humana. Esta leguminosa es una planta autóctona del continente europeo, que está bien adaptada a las condiciones climáticas de otras regiones como puede ser Australia o América. También crece de forma silvestre en suelos pobres gracias a su capacidad para fijar nitrógeno en simbiosis con bacterias. La adaptación de dicha planta puede deberse en parte a los microorganismos asociados a sus raíces, que le proporcionan estabilidad y resistencia, además de moléculas promotoras del crecimiento vegetal y nutrientes. Las comunidades microbianas asociadas a las plantas se ven influenciadas por diversos factores como son el genotipo/especie del huésped, el tipo de suelo, compartimento de la planta y estación climática, entre otros. Separar estos factores para saber cuáles son los que más influyen en la asociación de microorganismos a las plantas es una tarea muy complicada puesto que ninguno se da de forma independiente. En el primer capítulo de esta tesis doctoral, se abordó esta temática estudiando las variaciones estacionales y geográficas de la microbiota del suelo, y caracterizando el microbioma asociado a la planta Lupinus angustifolius en diferentes condiciones de cultivo mediante técnicas independientes de cultivo. En el segundo capítulo, el objetivo fue el aislamiento e identificación molecular de la comunidad bacteriana presente en los distintos tejidos de la planta y la generación de una colección de cepas asociada al microbioma de L. angustifolius. Con los resultados obtenidos en los dos primeros capítulos, se describió por primera vez el microbioma core de la planta L. angustifolius. En el tercer y último capítulo de esta tesis doctoral se trató de descifrar las interacciones de Micromonospora con su planta huésped y el microbioma asociado, empleando para tal fin la información obtenida en los capítulos anteriores. Se desarrollaron siete comunidades sintéticas que se inocularon en experimentos in planta, en condiciones de invernadero en un suelo con su comunidad natural, y en un sistema gnotobiótico con un sustrato estéril. Posteriormente se evaluó mediante técnicas independientes de cultivo cómo se ensamblaban los microorganismos a la raíz y cuál era el efecto de las distintas SynComs en la planta huésped y el microbioma circundante. [EN] The European Union highly depends on soy imports (> 70%) as a protein source since local production barely covers 5% of its internal demand. Thus, it is necessary to explore alternative sources to reduce this dependency. Among legumes, Lupinus angustifolius is an important alternative given its high protein value and use for animal and human nutrition. This legume is a native plant of Europe, well adapted to the climatic conditions of many countries. It also thrives in poor soils due to its capacity to fix nitrogen. Plant adaptation may be partly due to the microorganisms associated with its roots, providing stability and resilience, in addition to plant growth promoting molecules and nutrients. Plant-associated microbial communities are influenced by several factors such as host genotype/species, soil type, plant compartment and climatic season, among others. Separating these factors to understand which are the most influential in the association of microorganisms to plants is a very complex task as they do not occur independently. In the first chapter of this doctoral thesis, this topic was addressed by studying seasonal and geographical variations in the soil microbiota, and characterizing the microbiome associated with the plant Lupinus angustifolius under different cultivation conditions using an independent culture methodology. The results of the soil samples analysed suggest that the difference in the microbial community composition observed between the two sampling locations, Cabrerizos and Salamanca, was partly due to differences in soil conditions. None of the communities analysed (bacterial and fungal) showed differences in alpha diversity (Shannon index) between the climatic seasons in which the samples were collected. Beta diversity (Bray-Curtis-based principal coordinate analysis) for both microbial communities separated the samples into two groups according to soil type. In the case of bacteria, it was observed that, in addition, subgroups were formed according to the climatic seasons for the Salamanca soil. Interestingly, this also occurred with the fungal communities, where the samples were separated by season in both soil types. These results suggest that the main difference in soil microbial communities is due to edaphic properties, although environmental factors such as temperature, humidity or rainfall also influence the diversity of soil microbial communities. In addition, the microbiome associated with the legume Lupinus angustifolius cultivated under natural and greenhouse conditions was also characterized. For this purpose, wild and greenhouse-grown plants were collected from the same locations and analysed by 16S rRNA gene and ITS-2 gene profiling. Bacterial communities were characterized in the different plant compartments (rhizosphere, roots, nodules and leaves) while ITS profiles were restricted to the soil and rhizosphere. As previously reported for other plants, the highest richness was found in the rhizosphere, followed by the roots, leaves, and nodules. Within the rhizosphere, the bacterial richness in the in Salamanca plants was lower, especially for the field samples, probably affected by a pH below 7 and high amounts of P and K. In general, the compartments from the plants grown under greenhouse conditions showed a slightly higher bacterial diversity when compared to the wild plants. Within the fungal communities, the Shannon index was significantly higher in soil than rhizosphere samples (P<0.0001). In soils, diversity was similar for all seasons, except for spring, being lower in both locations, while in the rhizosphere, the field samples from Cabrerizos registered a significantly higher diversity than the greenhouse samples while the opposite occurred in Salamanca (P<0.0001). In both growing conditions and soils, the phyla with the highest cumulative relative abundance in all plant compartments were Pseudomonadota (Alphaproteobacteria - the most abundant taxon) and Mucoromycota. It was confirmed that L. angustifolius is a plant with a high bacterial and fungal diversity associated. In the second chapter, the objective was the isolation and molecular identification of the bacterial community present in the different plant tissues of L. angustifolius, to generate a collection of strains for downstream studies. Based on the metagenomics results, we selected 52 target genera with a relative abundance >1% and designed several isolation protocols. A total of 722 bacterial strains were isolated. As expected, the highest number of isolates was obtained in the rhizosphere compartment and a similar pattern was observed with a decreasing diversity gradient starting from the rhizosphere followed by the roots, leaves and nodules. In total, 87 different genera were identified, of which 19 had more than 10 isolates. The most abundant strains were identified in the genera Pseudomonas, Streptomyces, Agrobacterium, Bacillus and Pseudoclavibacter. In this work, 51.9% of the searched genera were isolated, and 74.7% of the isolated genera were identified by metagenomics, but 19.6% could not be detected in any plant compartment by metagenomics. Plant pathogenicity assays showed that 29% of the L. angustifolius isolates were potentially pathogenic for Arabidopsis thaliana Col-0. In turn, 394 strains (55%) were found to be non-pathogenic and 116 (16%) promoted the growth of A. thaliana. Analysis of metagenomics and culturomics results identified a core microbiome of the host plant L. angustifolius that included Acidovorax, Bradyrhizobium, Caulobacter, Chitinophaga, Flavobacterium, Kribella, Massilia, Pseudomonas, Pseudoxanthomonas, Rhizobium, Sphingomonas, Streptomyces and Variovorax. The composition and diversity of the identified host plant-associated bacteriome varied slightly between sampling locations and growing conditions. The genera identified as the core microbiome were present in more than 80% of the samples analysed. In chapter three of this work, the aim was to decipher the interactions of Micromonospora with its host plant and the associated microbiome, using the information obtained in the previous two chapters. Seven different synthetic communities (SynComs) were designed using bacterial strains isolated from the rhizosphere and roots of L. angustifolius to study their effect on the root and rhizosphere of the plant. In addition, we wanted to learn if the selected strains had any effect on the host plant and the natural bacterial communities present in the cultivation soils. After obtaining the genomes of the bacterial strains included in the different SynComs, a comparative genomic analysis was carried out, confirming that all the selected strains had genes with functions related to plant association and growth promotion. Plants were grown for 8 weeks in unsterilised soil under greenhouse conditions, and several plant parameters were measured and compared against the control plants (uninoculated). The plants inoculated with SynCom_7 showed the best growth and development. Furthermore, 16S rRNA gene profiling showed that the soil samples were the most diverse, followed by rhizosphere and roots (alpha diversity) (Figs. 54 and 55). Beta diversity grouped the samples into three clusters according to compartments: soil, rhizosphere and roots. In addition, a clustering pattern was observed for the SynComs inoculated in the root samples. All consortia that contained the nitrogen fixer, Bradyrhizobium sp. in the synthetic community formed one cluster, while the rest of the SynComs were recovered in a second cluster. The analysis of the bacterial composition of the bulk soil samples confirmed that the synthetic communities did not affect the composition of the soil where the plant was growing. However, when we studied the bacterial composition in the rhizosphere, a slight variation was observed, and the bacterial community of root samples was greatly influenced by the inoculated SynComs. The second part of this chapter consisted in the evaluation of the different SynComs on L. angustifolius plants grown in sterile soil under a gnotobiotic system. As in the first experiment, several growth parameters were registered, observing that plants inoculated with SynCom_7 showed the highest growths, again. Pseudomonas sp. Strain CRA141 showed the closest association with the roots. This result is not unexpected as it is well known that many Pseudomonas strains associate to plant roots. In addition, it was found that Micromonospora sp. Lupac 08 was detected in the rhizosphere and roots, and while this actinobacterium is not part of the core microbiome, it could be considered a "satellite" microorganism with important beneficial functions for the plant. Plant gene expression was related to the effect of the SynComs inoculated. When inoculated consortia included the Bradyrhizobium strain, very little differences were found when compared to the control plants, however, when only the Micromonospora strain and/or the other members of the SynComs were added, the differential gene expression increased threefold (Fig. 62). Gene ontology enrichment analyses revealed that those functions that were enriched by inoculating the different SynComs were clearly related to plant-microbe interaction functions. The same was observed for the enriched metabolic pathways when KEGG analysis was performed.

Impact of Trichoderma on the microbiome of wheat crop plants and its biostimulant potential under water stress conditions

Sun, 01 Jan 2023 00:00:00 GMT

[ES]La agricultura es uno de los pilares básicos de la sociedad actual, cuyo crecimiento constante demanda un aumento de la producción de los cultivos para asegurar el abastecimiento de toda la población. Sin embargo, todas las predicciones apuntan a que en los próximos años el cambio climático afectará negativamente a la producción de cultivos y la seguridad alimentaria en todo el mundo. El trigo es uno de los cultivos más consumidos a nivel mundial y constituye un alimento base y en muchos casos necesario en la dieta de una gran parte de los seres humanos y también de los animales. Sin embargo, su producción se ve negativamente afectada por los episodios de sequía, cada vez más intensos y frecuentes a causa del cambio climático. En este contexto, la agricultura moderna tiene como desafío conseguir un aumento de la producción agrícola, así como la resiliencia y adaptación de los cultivos a la variación de las condiciones medioambientales. No obstante, las prácticas agrícolas actuales son altamente dependientes del uso de agroquímicos, cuya inadecuada y, en muchos casos, indiscriminada aplicación está causando problemas de contaminación y pérdida de la biodiversidad del suelo. En los últimos años, el uso de microorganismos como bioestimulantes y biofertilizantes ha surgido como una alternativa prometedora para sustituir o reducir los insumos químicos en los sistemas agrícolas. La presente tesis doctoral está enfocada en estudiar el potencial de Trichoderma como bioestimulante en plantas de trigo en condiciones de escasez de agua, así como el efecto de su aplicación en el microbioma de este cultivo. [EN]Agriculture is part of the backbone of our current society, whose constant growth demands an increase in crop yields to ensure the supply of the entire population. However, all predictions point out that climate change will negatively affect crop production and food security worldwide in the coming years. Wheat is one of the most widely consumed crops in the world, being a staple food and in many cases necessary in the diet of a large part of humans and also of animals. However, its production is negatively affected by drought episodes, which are becoming more intense and frequent due to climate change. In this context, the challenge for modern agriculture is to achieve yield increases as well as the resilience and adaptation of crops to variations in environmental conditions. However, current agronomic practices are highly dependent on the use of agrochemicals, whose inadequate and sometimes indiscriminate application is causing soil contamination and biodiversity losses. In recent years, the use of microorganisms as biostimulants and biofertilizers has emerged as a promising alternative to replace or reduce chemical inputs in agricultural systems. The present doctoral thesis is focused on evaluating the potential of Trichoderma as a biostimulant agent in wheat plants under water scarcity conditions, as well as the effect of its application on the microbiome of this crop.

Regulación de las cadenas nacientes bajo estrés replicativo por el checkpoint de fase S

Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 GMT

[ES] En esta tesis doctoral pretendemos contribuir al conocimiento sobre la regulación que el checkpoint de fase S lleva a cabo en respuesta al estrés replicativo sobre la replicación del DNA, la maquinaria replicativa y la estabilización de las horquillas de replicación. Para ello, nos propusimos los siguientes objetivos: • Estudiar los efectos de la fosforilación de Exo1 mediada por el checkpoint de fase S en respuesta al estrés replicativo. • Estudiar la posible regulación diferencial del checkpoint de fase S sobre la replicación de las cadenas leading y lagging en respuesta al estrés replicativo.

Implicación del exómero en la respuesta a estrés de Schizosaccharomyces pombe

Mon, 01 Jan 2018 00:00:00 GMT

[ES] En un trabajo anterior del laboratorio se había descubierto que en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe las proteínas Cfr1 y Bch1 constituyen la forma más sencilla posible de un exómero, formado por un equivalente a Chs5 y una única ChAP (Hoya et al., 2017). Además, se demostró que este exómero mínimo es funcional. La proteína Cfr1 interacciona físicamente con algunos de los adaptadores de clatrina (los complejos AP-1 y AP-2 y los GGAs), y el gen cfr1+ interacciona genéticamente con apm1+, gga21+ y gga22+. La colaboración entre Cfr1 y el complejo AP-1 es necesaria para que la morfología e integridad del Trans-Golgi Network y de los endosomas tempranos sean correctas, mientras que la colaboración entre los GGAs y el exómero es necesaria para el mantenimiento del sistema prevacuolar y de las vacuolas (Hoya et al., 2017). De acuerdo con una función del exómero en varios pasos del tráfico vesicular, y no con el transporte de una proteína en concreto, la falta del exómero presenta una serie de fenotipos, no muy exacerbados, que en principio no parecen estar directamente relacionados entre sí: alteraciones en la morfología del aparato de Golgi, defectos en el tráfico de la carboxipeptidasa o una mala distribución de la sinaptobrevina. Además de los fenotipos mencionados anteriormente, los mutantes del exómero (cfr1Δ, bch1Δ y cfr1Δ bch1Δ) son sensibles a Caspofungina, un antifúngico que afecta a la pared celular, y presentan una cantidad reducida de los niveles de β (1,3)-glucano (que se ve compensada con un incremento en la cantidad de α-glucano). Los mutantes del exómero presentan, también, una ligera disminución del crecimiento a 37ºC o en medio mínimo. Cabe destacar una clara sensibilidad a cloruro de potasio, de modo que los mutantes tienen un crecimiento ralentizado en presencia de KCl a 0,6 M y son incapaces de crecer a una concentración de 1 M de la sal. El KCl no solo provoca defectos en el crecimiento, sino que tratamientos largos (de dieciséis horas) con esta sal (a una concentración de 0,6 M y a una temperatura de 25ºC) provocan la aparición de un septo mal formado con engrosamientos (figura 13) (Hoya et al., 2017). Los objetivos de esta Tesis Doctoral, que se fijaron en base a los fenotipos observados en los mutantes del exómero de S. pombe en respuesta al estrés producido por cloruro de potasio, fueron los siguientes: Objetivo principal: Conocer el papel del exómero de Schizosaccharomyces pombe en la respuesta a estrés. Objetivos específicos: - Caracterizar el defecto de los mutantes cfr1Δ y bch1Δ en la citocinesis y en la sensibilidad a estrés en presencia de compuestos inductores de estrés, en particular de KCl. - Averiguar la relación entre el exómero y las rutas de respuesta a estrés. - Buscar proteínas que colaboren con el exómero en el proceso de citocinesis y en la respuesta a estrés.

Sistemas de Dos Componentes de Streptomyces coelicolor, pilares en la producción de antibióticos

Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 GMT

[ES] A lo largo de la Tesis Doctoral se han seguido diferentes aproximaciones para estudiar TCS de S. coelicolor implicados en la producción de antibióticos de cara a su aplicación biotecnológica. Resulta esencial tanto terminar de esclarecer las cascadas de señalización de sistemas ya descritos, como identificar y caracterizar sistemas que no hayan sido estudiados previamente, de cara a completar el complejo entramado regulatorio que presenta este organismo. Así mismo, el desarrollo de nuevas herramientas metodológicas para el estudio de estos sistemas es fundamental para facilitar y ampliar las futuras investigaciones. Los objetivos de este trabajo fueron: 1. Caracterizar el papel fisiológico del Sistema de Dos Componentes SCO2165/66 (abrB1/B2) de Streptomyces coelicolor y su implicación en la producción de antibióticos. 2. Identificar los genes diana del Regulador de Respuesta huérfano Aor1 (SCO2281) de Streptomyces coelicolor. 3. Diseñar y construir una plataforma para la identificación de las señales de activación de las Histidina Quinasas en Streptomyces. Las conclusiones del trabajo son: CAPÍTULO 1. El Sistema de Dos Componentes AbrB1/B2 • El Sistema de Dos Componentes AbrB1/B2, constituido por los genes SCO2165/66 de Streptomyces coelicolor, se encuentra muy conservado en las bacterias del género Streptomyces. • El sistema AbrB1/B2 es un regulador negativo de la producción de los antibióticos actinorrodina y undecilprodigiosina, y no está implicado en la regulación del crecimiento ni el desarrollo morfológico. Este sistema parece actuar a través de la represión de los reguladores positivos de la producción de antibióticos EcrA1/A2 y ScbR2. • El sistema AbrB1/B2 es un regulador positivo de la resistencia a vancomicina, lo que da lugar a alteraciones en diversos procesos metabólicos y de respuesta a estrés; además, es homólogo de VraR/S (Staphylococcus aureus) y LiaR/S (Enterococcus faecium), implicados en la respuesta a daño en la pared celular. • La cepa de Streptomyces coelicolor en la que se ha delecionado AbrB1/B2 presenta ventajas sobre la cepa silvestre para la expresión de rutas heterólogas de antibióticos y antitumorales como lo demuestra el hecho de la mayor expresión de las rutas de oviedomicina y mitramicina en la cepa mutante. • La obtención de un mutante de Streptomyces coelicolor en los dos Sistemas de Dos Componentes AbrA1/A2 y AbrB1/B2 demuestra que, a nivel fenotípico, la mutación AbrB1/B2 predomina sobre la de AbrA1/A2. CAPÍTULO 2. El Regulador de Respuesta huérfano Aor1 • El Regulador de Respuesta huérfano Aor1 se produce en Streptomyces coelicolor principalmente al final de la fase exponencial de crecimiento (36 horas) y su sobreexpresión con distintas etiquetas en el extremo amino-terminal resulta tóxica. • Aun disponiendo de anticuerpos específicos frente a Aor1, no se ha podido completar la identificación de las secuencias diana de Aor1 por ChIP-Seq debido a problemas en el proceso de inmunoprecipitación. CAPÍTULO 3. Plataforma HKASP • Se ha completado el diseño y construcción de una plataforma para la identificación de las señales de activación de las distintas Histidina Quinasas en Streptomyces. Sin embargo, no se ha podido completar su validación durante la realización de este trabajo.