Identificación de proteínas implicadas en la interacción arabidopsis-pseudomonas mediante tecnología "phage-display". caracterización funcional de aterf1 y erf1 en respuesta a estrés

Abstract

[EN] Phage-display technology can be used to express and select for Arabidopsis proteins with functional microbe-binding domains. In this Thesis, two libraries for phage-mediated display of Arabidopsis proteins were constructed. A biopanning procedure using living cell of Pseudomonas sp. was used for selection of particular phage clones, such as T7-ATERF-1, which confirmed their microbe-binding capacity in competitive assays. DNA-microarray hybridization was used to high-throughput quantify clone enrichment during the selection. Significance analysis of microarray data produced upon hybridization of bio-panned libraries identified 472 genes as putative binders of bacterial molecules. GFP-ATERF-1 translocates from the nucleus to the cytoplasm upon infiltration with Pseudomonas components into the leaves of transgenic tobacco and Arabidopsis plants. A loss-of-function aterf-1 mutant is more sensitive to Pst than Col-0, which demonstrates that ATERF-1 is required for a proper immune response in vivo. The overexpression of ERF1 in Arabidopsis confers tolerance to drought. Specifically, under drought conditions ERF1 blocks the induction of the transcriptional drought-repressors DEAR5 and AtERF4 allowing the transcription of drought-responsive genes, and consequently an enhanced drought response. ERF1 expression is increased after drought stress and this expression is ET-dependent. Furthermore, ERF1 expression is decreased by ABA-treatment through an ET-independent pathway, suggesting ERF1 is a key node in the interaction between ABA and ET signalling pathways during abiotic stress. ERF1 overexpression prevents early seedling growth during salt and osmotic stresses and confers hypersensitivity to exogenous addition of ABA. ERF1 acts downstream of HAB2 in the ABA signalling pathway that regulates early seedling establishment and is able to antagonize HAB2 function. The overexpression of ERF1 promotes ABI5 protein accumulation, both in absence and presence of ABA, early in the post-germinative period. Our results suggest that transgenic 35S:ERF1 plants show delayed seedling establishment in response to abiotic stress or exogenous ABA, due to these higher ABI5 levels.

[ES] Las plantas están en continua interacción con el ambiente y debido a su naturaleza sésil, han evolucionado y desarrollado complejos mecanismos de respuesta al ataque de patógenos (estrés biótico) o a las condiciones adversas (estrés abiótico). En esta Tesis se ha profundizado en los mecanismos moleculares de las respuestas a estrés, tanto biótico como abiótico en Arabidopsis thaliana . En el primer capítulo de este trabajo se ha estudiado la interacción Arabidopsis- Pseudomonas desarrollando una nueva estrategia para la búsqueda de proteínas vegetales implicadas en la percepción del patógeno. Empleando la tecnología phagedisplay se ha expresado el transcriptoma de Arabidopsis en respuesta a tres cepas bacterianas (P.aeruginosa PA14, el aislado virulento P.syringae DC3000 y su variante avirulenta P.syringae DC3000+avrRpt2) representando así, diferentes grados de especificidad en la interacción planta-microorganismo. Las genotecas “phage display”, construidas a partir de cDNA de plantas infectadas, representan aproximadamente 2x107 transcritos vegetales diferentes que se expresan de forma funcional en la superficie del fago T7. Mediante una técnica complementaria denominada biopanning, se han seleccionado e identificado aquellos fagos individuales que expresen una proteína heteróloga capaz de unirse físicamente a células bacterianas, entre ellos ATERF-1 (Factor de Transcripción de Respuesta al Etileno 1). El papel de ATERF-1 en respuesta al patógeno ha sido también demostrado in vivo. Se ha estudiado la localización de ATERF-1 en plantas de Tabaco y Arabidopsis y se ha visto que la construcción GFP-ATERF-1 se transloca desde el núcleo al citoplasma tras el contacto con la bacteria. Adicionalmente, el mutante de pérdida de función aterf-1 es más susceptible a la infección que el genotipo silvestre Col-0, demostrando así, el papel de la proteína en la respuesta inmune. La selección de clones con afinidad física por células vivas de Pseudomonas ha sido monitorizada mediante la hibridación de microarrays con el objeto de comparar la colección de clones inicial vs. seleccionados. Esto ha permitido por una parte cuantificar el enriquecimiento de clones específicos, y por otra identificar un total de 418 genes de Arabidopsis que posiblemente participen en la percepción de Pseudomonas, o que puedan tener afinidad por alguna de las partes del microorganismo. De entre todos estos genes, algunos ya estaban anotados como genes de defensa y otros podrían ser anotados a partir de este estudio. En el segundo capítulo de esta tesis, se ha estudiado el papel de ERF1 en la respuesta a estrés abiótico. Esta proteína pertenece a la misma familia que ATERF- 1, identificada en el cribado de la primera parte de esta tesis, y es el miembro mejor estudiado de la subfamilia AP2/ERF (Apetala 2/Factores de transcripción de Respuesta al Etileno) en relación con la respuesta a patógenos necrótrofos y a la integración de las señales de Etileno (ET) y Jasmónico (JA). En esta Tesis se ha demostrado que la sobreexpresión de ERF1 en plantas adultas confiere tolerancia a la sequía y desreprime a los factores de transcripción AtERF4 y DEAR5, propuestos como dianas directas de la regulación transcripcional por ERF1. Esta respuesta mediada por ERF1 es también dependiente de EIN2, un componente clave de la ruta de señalización por ET. Por otro lado, plantas transgénicas que sobreexpresan ERF1 presentan un retraso en el desarrollo temprano de plántulas cuando son sometidas a otros estreses abióticos (salino y osmótico), o cuando son tratadas con la fitohormona Ácido Abscísico (ABA), que regula el cierre de los estomas en las hojas como respuesta a la sequía. El retraso en la germinación de semillas está relacionado con un aumento en los niveles de ABI5, una proteína clave en el proceso post-germinativo que se acumula en semillas transgénicas que sobreexpresan ERF1. Por último, en este trabajo se ha demostrado que ERF1 es epistático en la ruta de señalización del ABA y que actúa debajo de HAB2, una proteín-fosfatasa de tipo PP2C implicada en el complejo receptor del ABA y que actúa como regulador negativo, dando evidencias de una interacción hormonal ET-ABA durante el establecimiento de la plántula en Arabidopsis.