Regulación del tráfico intracelular de la actividad Quitín Sintasa III en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

[ES] La pared celular de levaduras está compuesta por una serie de capas, entre las cuales se encuentra la quitina. Este compuesto, a pesar de ser minoritario, es esencial para la viabilidad de Saccharomyces cerevisiae. Chs3 es la subunidad catalítica de la actividad Quitín Sintasa III (QSIII) y es responsable de la síntesis de la mayor parte de la quitina presente en la pared celular. Esta proteína presenta una regulación muy compleja que va a permitir que se localice en el cuello de la levadura durante momentos muy discretos del ciclo celular. Dicha regulación tiene lugar a nivel a nivel postraduccional y es mediada por una serie de proteínas que se han denominado Chs (de Chitin synthesis). En ausencia de las mismas Chs3 es incapaz de alcanzar la membrana plasmática, quedando retenida en diferentes compartimentos intracelulares de la ruta de secreción dependiendo del mutante. Esta regulación tan compleja de Chs3 ha hecho que haya sido ampliamente estudiada como modelo del tráfico intracelular regulado de proteínas.

En este trabajo nos propusimos como primer objetivo profundizar en el estudio de la estructura-función de los distintos dominios de Chs3. Hemos visto que Chs3 es una proteína capaz de formar dímeros en el retículo endoplasmático a través de su extremo N-terminal. La adquisición de la estructura cuaternaria por parte de Chs3 es un proceso altamente regulado, de manera que los monómeros que se escapan del retículo endoplasmático son devueltos al mismo en vesículas COPI, participando la proteína Rer1 en este sistema de control de calidad. Además, la oligomerización de Chs3 es una conformación importante para la correcta cristalización de la quitina. Por otra parte, el dominio C-terminal desempeña tres funciones: es necesario para la interacción con la subunidad Chs6 del exómero, una maquinaria necesaria para la salida de Chs3 desde el trans-Golgi Network (TGN) hacia la membrana plasmática; media el retorno de los monómero de Chs3 desde el cis-Golgi hacia el retículo endoplasmático en vesículas COPI; y es imprescindible para la propia actividad catalítica. Finalmente, el dominio globular central, donde reside el centro catalítico, también está implicado en la regulación del tráfico intracelular de Chs3.

Un segundo objetivo ha sido profundizar en la función de Chs4, la proteína que activa y localiza a Chs3 en la membrana plasmática. Trabajo previo en el laboratorio había demostrado que Chs4 estabiliza a Chs3 en el cuello de la membrana plasmática impidiendo su endocitosis. En este trabajo hemos descrito que esto es posible gracias a la existencia de un compartimento en el cuello, en el cual reside Chs3 y donde otras proteínas de la membrana plasmática que no están polarizadas se encuentran excluidas. Este compartimento está definido por dos anillos concéntricos, correspondientes con el anillo de septinas y un anillo constituido por la maquinaria endocítica que se dispone perifericamente al primero y en forma de parches. Chs3 sería transportada de forma polarizada hacia la región de membrana delimitada entre ambos anillos, mediando Chs4 el anclaje a las septinas. Este anclaje prevendría el acceso de Chs3 a la maquinaria endocítica dispuesta en la periferia. Eventualmente, se produciría la liberación de las moléculas Chs3 de las septinas, de manera que podrían difundir por el compartimento delimitado en el cuello, hasta entrar en contacto con los parches de endocitosis que median la internalización de Chs3. Durante el crecimiento hiperpolarizado de conjugación, sin embargo, hay un desacoplamiento entre las septinas y la región de endocitosis, de manera que la polarización de Chs3 durante la conjugación es independiente de endocitosis.

[EN] The yeast cell wall is composed of a series of layers, among which is chitin. This compound, although the minority, is essential to the viability of Saccharomyces cerevisiae. Is the catalytic subunit Chs3 activity Quitín synthase III (QSIII) and is responsible for the synthesis of most of the chitin present in the cell wall. This protein has a highly complex regulation will allow localized in the neck during very discrete yeast cell cycle. Such regulation occurs at a post translational level and is mediated by a series of proteins which have been termed Chs (Chitin synthesis). In their absence Chs3 is unable to reach the plasma membrane, being retained in intracellular compartments secretory pathway depending mutant. This regulation so complex Chs3 has made has been widely studied as a model of regulated intracellular protein trafficking.

In this paper we set as its first objective to deepen the study of the structure-function Chs3 different domains. Chs3 seen that a protein capable of forming dimers in the endoplasmic reticulum through its N-terminal. Acquiring by quaternary structure Chs3 is a highly regulated process, so that the monomers escaping the endoplasmic reticulum are reimbursed in COPI vesicles participating in this Rer1 protein quality control system. Furthermore, Chs3 oligomerization is important for proper conformation of chitin crystallization. Moreover, the C-terminal domain has three functions: it is necessary for interaction with the exómero Chs6 subunit, an engine output required for the Chs3 from the trans-Golgi Network (TGN) to the plasma membrane, half the return Chs3 the monomer from the cis-Golgi to the ER in COPI vesicles, and is essential for catalytic activity itself. Finally, the central globular domain, where resides the catalytic center is also involved in the regulation of intracellular trafficking Chs3.

A second objective was to investigate the role of cHS4, the active protein that localizes to the plasma membrane Chs3. Previous work in the laboratory had shown that cHS4 Chs3 stabilizes the neck of the plasma membrane preventing their endocytosis. In this paper we described that this is possible thanks to the existence of a compartment in the neck, which resides Chs3 and where other plasma membrane proteins that are excluded are polarized. This compartment is defined by two concentric rings with the corresponding septin ring and a ring formed by the endocytic machinery which provides the first and peripherally in the form of patches. Chs3 be transported in a polarized manner into membrane region delimited between the two rings, cHS4 mediating anchoring to the septin. This anchor Chs3 prevent access of the endocytic machinery disposed at the periphery. Eventually occur release of molecules Chs3 septin so that could diffuse the compartment delimited by the collar, to contact patches endocytosis mediating internalization Chs3. Hyperpolarized growth during conjugation, however, there is a decoupling between the septin and endocytosis region, so that the polarization of Chs3 during conjugation is independent of endocytosis.