Nuevos mecanismos reguladores de la activación y funciones efectoras de la oncopoteína Vav1 en linfocitos

Abstract

[ES]La familia de proteínas Vav es un grupo de moléculas de transducción de señales con potencial oncogénico que juegan un papel importante en el desarrollo y la señalización celular (Bustelo, 2000; Bustelo, 2001; Turner and Billadeau, 2002). Las proteínas Vav promueven el intercambio de nucleótidos de guanosina en proteínas de unión a GTP de la familia Rho/Rac, una acción que facilita la transición de estas GTPasas de su estado inactivo (unido a GDP) a su estado activo (unido a GTP) (Crespo et al., 1997; Han et al., 1997; Bustelo, 2000; Bustelo, 2001). Esta familia tiene tres miembros en mamíferos: Vav1, Vav2 y Vav3. La propiedad funcional más distintiva de los miembros de la familia Vav es el hecho de que sus actividades enzimáticas son estimuladas por fosforilación en tirosinas (Crespo et al., 1997; Schuebel et al., 1998; Movilla and Bustelo, 1999; Lopez-Lago et al.,2000; Zugaza et al., 2002). Se sabe que dicha regulación conlleva una serie de cambios intramoleculares en las proteínas Vav que resultan en la exposición de los sitios de unión a GTPasas que se encuentran en sus dominios catalíticos y , como consecuencia, facilita la efectiva interacción con las GTPasas (Aghazadeh et al., 2000; Lopez-Lago et al., 2000; Yu et al., 2010). Las mutaciones que eliminan la regulación dependiente de fosforilación causan la activación oncogénica de las proteínas Vav, un resultado que subraya el importante rol que esta regulación juega en el desencadenamiento de respuestas fisiológicas completas (Bustelo and Barbacid, 1992; Bustelo et al., 1992; Aghazadeh et al., 2000; Lopez-Lago et al., 2000). Estudios estructurales han mostrado que la tirosina 174 es el residuo clave de la activación/desactivación de Vav1 durante la señalización celular (Aghazadeh et al., 2000; Lopez-Lago et al., 2000). Este mecanismo está muy conservado dentro de los miembros de la familia Vav caracterizados tanto en vertebrados como en invertebrados.

En este trabajo de tesis se ha abordado los siguientes objetivos:

1. Caracterización de nuevos mecanismos reguladores de la función de Vav1 en linfocitos.

2. Identificación de los principales sitios de fosforilación presentes en Vav1.

3. Determinación de la cinética de fosforilación de los aminoácidos identificados usando una colección de nuevos anticuerpos fosofoespecíficos contra Vav1.

4. Estudio de los roles reguladores y/o efectores de los sitios de fosforilación de Vav1 identificados en nuestro análisis.

5. Análisis de los elementos de la señalización celular que regulan la activación de Vav1 en linfocitos.

Las conclusiones obtenidas del desarrollo experimental de los mismos fueron las siguientes:

1. La estructura autoinhibida de la proteína Vav1 se establece gracias a la interacción coordinada de las regiones N- y C-terminales con el núcleo central catalítico de esta proteína. Esta inhibición impide el desarrollo de las respuestas celulares asociadas a la proteína Vav1 en linfocitos.

2. El dominio CSH3 inhibe la actividad de esta proteína mediante su unión en cis a la región DH-PH. La inhibición de Vav1 es mediada por la acción cooperativa de aminoácidos del RT-loop y el extremo C-terminal del CSH3.

3. La activación fisiológica de la proteína Vav1 se produce a través de efectos sinérgicos de la fosforilación de tirosinas localizadas en las regiones Ac, ZF y CSH3.

4. Las mutaciones en estos sitios de fosforilación afectan diferencialmente a la activación de Rac1/JNK y NF-AT, sugiriendo la existencia de distintos estados conformacionales de la proteína Vav1 que regulan específicamente las respuestas celulares asociadas a ésta.

5. La activación de la proteína Vav1 es, principalmente, mediada por la acción cooperativa de las quinasas de la familia Src y, en menor medida, por la quinasa Zap70. La presencia de la proteína Lat es esencial para la óptima activación de la proteína Vav1 y para el reclutamiento de esta a la membrana plasmática.

6. Existe un mecanismo de regulación negativa de la activación de la proteína Vav1 en el que está implicado un PTPasa aún no identificada. Para el desarrollo de este mecanismo es necesaria la presencia de las proteínas Slp76 y PLC¿1.

[EN] In this work of thesis the following aims have been approached: 1. Characterization of new regulatory mechanisms of the function of Vav1 in lymphocytes. 2. Identification of the principal sites of fosforilación presents in Vav1. 3. Determination of the kinetic one of fosforilación of the identified amino acids using a collection of new antibodies fosofoespecíficos against Vav1. 4. Study of the regulatory roles and / or efectores of the sites of fosforilación of Vav1 identified in our analysis. 5. Analysis of the elements of the cellular signposting that regulate the activation of Vav1 in lymphocytes.