Desarrollo de un modelo experimental de estrés oxidativo in vivo

Abstract

[ES]Los efectos nocivos de las especies reactivas de oxígeno (ROS) se producen durante la vida adulta , y se ha sugerido que el exceso de ROS- estrés oxidativo puede ser un factor que contribuye a los procesos neurodegenerativos . El glutatión ( GSH ) es uno de los más abundantes antioxidantes y , en enfermedades neurológicas tales como la enfermedad de Parkinson o trastornos mentales , la deficiencia de GSH es el conocido indicador bioquímico más temprana de degeneration.This neuronales observación ha llevado a la sugerencia de que el estrés oxidativo puede estar detrás de la causas de la disfunción neuronal asociada con estos trastornos neurológicos . Desafortunadamente , debido a la falta de una herramienta suficientemente robusto , el efecto específico de la deficiencia de GSH en la patogénesis de enfermedades neurológicas nunca se ha demostrado in vivo , por lo tanto el papel real de GSH estrés oxidativo pérdida mediada en estos trastornos sigue siendo difícil de alcanzar .

El glutatión es un tripéptido ( g - glutamylcysteinilglycine ) sintetizado por dos reacciones dependientes de ATP consecutivos . El glutamato - cisteína ligasa ( GCL o sintetasa g - glutamilcisteína ; CE 6.3.2.2 ) cataliza la primera y limitante de la velocidad a paso , formando g - glutamilcisteína a partir del glutamato y cisteína . Esto es seguido por la glutatión sintetasa (CE 6.3.2.3 ) - reacción catalizada , que se une a G glicina - glutamilcisteína , la formación de glutatión . GCL es una enzima heterodimérica compuesta de un catalizador (pesado , 73 kDa ) y un modulador ( luz, 27,7 kDa ) subunidad . Estudios realizados con purificada GCL han demostrado que el sitio activo reside en la subunidad catalítica , mientras que la subunidad modulador aumenta la afinidad de la subunidad catalítica para el glutamato y disminuye la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por GSH . En el cerebro , donde - a lo mejor de nuestro , actividad GCL conocimiento - la enzima no ha sido purificada es muy débil , aunque es más alta en astrocitos en comparación con neurons.This contribuye a la mayor resistencia de los astrocitos , en comparación con las neuronas , contra el estrés oxidativo . Los astrocitos cooperan con las neuronas de la biosíntesis de GSH neuronal antioxidante mediante el suministro de los precursores de GSH . Por lo tanto , ya sea limitando el suministro de los precursores , o la capacidad de las neuronas para usarlos , provoca el estrés oxidativo en las neuronas que conducen a la neurodegeneración , por lo menos en la cultura . Esto nos ha llevado a la hipótesis de que desmontables neuronal específica y controlada temporalmente de GCL in vivo puede provocar una disfunción neurológica espontánea , lo que posiblemente imitando los problemas neurológicos asociados con el Parkinson o las enfermedades mentales y potencialmente útil para la identificación de proteínas redox-sensibles novedosos involucrado en trastornos neurológicos .

Los modelos existentes in vivo para el estudio de GCL , subunidad catalítica , la deficiencia en el cerebro son escasos y fracasaron. Ratones knockout homocigotos contra GCL , subunidad catalítica , no son viables más allá del día 8 de embriones , y los heterocigotos presentan mecanismos de compensación como el aumento de la biosíntesis de ascorbato. Además , este sistema genético disponible no knockout tejido GCL específicamente o temporalmente controlada , siendo por tanto inadecuados para investigar el papel del estrés oxidativo en el sistema nervioso central durante la edad adulta . Nos habíamos identificado previamente una pequeña horquilla de ARN ( shRNA ) dirigido contra GCL , subunidad catalítica de que, en las neuronas cultivadas, desencadena el estrés oxidativo espontáneo. Hemos implementado estrategia de ARNi in vivo para producir un ratón de doble condicional que expresa la GCL shRNA en las células del sistema nervioso central , en particular las neuronas del hipocampo , para volver a crear el estrés oxidativo in vivo t tejido de manera específica y en inducible . Utilizamos la tecnología Cre - LoxP para crear ratones que expresan shGCL en las neuronas in vivo , y se caracterizaron bioquímicamente , inmuno - histológica y comportamiento. Se encontró una disminución en la GCL , y un aumento de los marcadores oxidativos . También encontramos efectos dependientes del sexo en la caracterización del comportamiento para las tareas de ansiedad , la capacidad motora y memoria.

En conclusión , aquí se describe una estrategia novedosa para el estudio de estrés oxidativo in vivo de una manera específica y controlada en el tiempo el tejido . Este modelo puede abrir nuevas posibilidades para el estudio de la implicación de los elevados de ROS en las enfermedades mentales , como la enfermedad o la ansiedad de Alzheimer, que son intrínsecos a una serie de trastornos psiquiátricos como la depresión , ataques de pánico , fobias, trastorno obsesivo -compulsivo y el estrés postraumático , sin embargo , estas enfermedades carecen actualmente de apropiado en modelos in vivo para la investigación de nuevas estrategias terapéuticas. Además, puesto que hemos diseñado la herramienta genética con dos sitios de restricción únicos que flanquean la secuencia de ARNhc , nuevos modelos de ratones transgénicos podrían ser sencilla generada a desmontables cualquier otra proteína específica de tejido in vivo . Creemos que el modelo de ratón transgénico aquí descrito puede ser útil para una mejor comprensión de las consecuencias del estrés oxidativo en células específicas in vivo , así como para la evaluación de nuevos enfoques farmacológicos.

[EN]The deleterious effects of reactive oxygen species (ROS) occur during adulthood, and it has been suggested that excess ROS -oxidative stress- may be a contributing factor in neurodegenerative processes. Glutathione (GSH) is one of the most abundant antioxidants and, in neurological diseases such as Parkinson's disease or mental disorders, GSH deficiency is the earliest known biochemical indicator of neuronal degeneration.This observation has led to the suggestion that oxidative stress may be behind the causes of neuronal dysfunction associated with these neurological disorders. Unfortunately, due to the lack of a sufficiently robust tool, the specific effect of GSH deficiency in the pathogenesis of neurological diseases has never been shown in vivo, thus the actual role of GSH loss-mediated oxidative stress in these disorders still remains elusive.

Glutathione is a tripeptide (g-glutamylcysteinilglycine) synthesized by two consecutive ATP-dependent reactions. Glutamate-cysteine ligase (GCL or g-glutamylcysteine synthetase; EC 6.3.2.2) catalyzes the first -and rate-limiting- step, forming g-glutamylcysteine from glutamate and cysteine. This is followed by the glutathione synthetase (EC 6.3.2.3)-catalyzed reaction, which binds glycine to g-glutamylcysteine, forming glutathione. GCL is a heterodimeric enzyme composed of a catalytic (heavy; 73 kDa) and a modulatory (light; 27.7 kDa) subunit. Studies performed with purified GCL have shown that the active site resides at the catalytic subunit, whereas the modulatory subunit increases the affinity of the catalytic subunit for glutamate and decreases the sensitivity to feedback inhibition by GSH . In the brain, where -to the best of our knowledge- the enzyme has never been purified, GCL activity is very weak, although it is higher in astrocytes when compared with neurons.This contributes to the higher resistance of astrocytes, when compared with neurons, against oxidative stress. Astrocytes co-operate with neurons for neuronal antioxidant GSH biosynthesis by supplying GSH precursors. Thus, limiting either the supply of precursors, or the ability of neurons to use them, triggers oxidative stress in neurons leading to neurodegeneration, at least in culture. This has led us to hypothesize that neuronal-specific and temporally-controlled knockdown of GCL in vivo may lead to spontaneous neurological dysfunction, thus possibly mimicking the neurological problems associated with Parkinson's or mental diseases and potentially useful for the identification of novel redox-sensitive proteins involved in neurological disorders.

The existing in vivo models for studying GCL, catalytic subunit, deficiency in the brain are scarce and failed. Homozygous knockout mice against GCL, catalytic subunit, are not viable beyond embryonic day 8th, and the heterozygous ones display compensation mechanisms such as increased ascorbate biosynthesis. In addition, this available genetic system does not knockout GCL tissue specifically or temporally controlled, thus being unsuitable to investigate the role of oxidative stress in central nervous system during adulthood. We had previously identified a small hairpin RNA (shRNA) targeted against GCL, catalytic subunit that, in cultured neurons, triggered spontaneous oxidative stress. We have implemented RNAi strategy in vivo to produce a double-conditional mouse expressing the GCL shRNA in the cells of the central nervous system, particularly hippocampal neurons, to recreate oxidative stress in vivo t tissue specific and inducible way. We used Cre-LoxP technology to create mice expressing shGCL in neurons in vivo, and they were characterized biochemically, immuno-histologically and behaviorally. We found a decrease in GCL, and an increase in oxidative markers. We also found sex-dependent effects in behavioural characterization for anxiety, motor ability and memory tasks.

In conclusion, here we describe a novel strategy for studying oxidative stress in vivo in a tissue specific and time-controlled manner. This model may open new possibilities to study the involvement of elevated ROS in mental illnesses, such as Alzheimer's disease or anxiety, which are intrinsic to a number of psychiatric disorders including depression, panic attacks, phobias, obsessive-compulsive disorder and post-traumatic stress; however, these diseases currently lack of appropriate in vivo models for research on new therapeutic strategies. Furthermore, since we designed the genetic tool with two unique restriction sites flanking the shRNA sequence, new transgenic mice models could be straightforward generated to knockdown any other protein tissue-specifically in vivo. We believe that the transgenic mouse model herein described may be useful for a better understanding of the consequences of oxidative stress in specific cells in vivo, as well as for assessing novel pharmacological approaches.