Mecanismos molecurales y celulares de la neuroprotección y plasticidad inducida por factor neurotrófico derivado del cerebro

Abstract

[EN]Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a pro-survival protein, highly expressed in the hippocampus, with critical functions in both developing and adult neurons. BDNF preferentially binds to TrkB receptors activating, in parallel, the Ras-ERK, PI3K/AKT and PLCgamma signaling pathways. Under physiological conditions, BDNF regulates several mechanisms of synaptic plasticiy. Under pathological conditions, BDNF protects hippocampal neurons from glutamate excitotoxicity and ischemia. However, the precise molecular mechanisms BDNF triggers upon TrkB receptor activation to induce neuronal protection and/or recovery are not fully understood. This study sought to address these issues and further examine the possible link between BDNF-induced mechanisms of neuroprotection and/or recovery and mechanisms of synaptic plasticity. In the first part of this study we examined molecular alterations induced by excitotoxicity, focusing on the downregulation of glutamic acid decarboxylase, which likely affects inhibitory synaptic transmission. We found that excitotoxic stimulation of cultured hippocampal neurons with glutamate leads to a time-dependent N-terminal cleavage of glutamic acid decarboxylase isoforms GAD65 and GAD67, upon ubiquitination and degradation of an unknown binding partner by the proteasome. The characteristic punctate distribution of GAD65 along neurites of differentiated cultured hippocampal neurons and total GAD activity measured in cerebellum or cerebral cortex extracts were significantly reduced. The results showed the deregulation of GADs under excitotoxic conditions, which most likely affects GABAergic neurotransmission, upon UPS activity, in addition to other proteolytic systems previously implicated in glutamate-induced excitotoxicity (Please refer to chapter 1). We then further evaluated the differential activation of the three main proteolytic mechanisms (UPS, calpains and caspases) implicated in excitotoxicity. We sought to study the protective effect of BDNF in different neuronal compartments and time points towards best understanding the spatiotemporal activation of BDNF-induced mechanisms of neuroprotection. These results showed a time-dependent activation of proteases and spatial segregation of these mechanisms. Calpain activation was followed by proteasome deregulation, in synaptic terminals and neuronal processes. Caspase activation subsequetly occurred in the cell body and all proteolytic mechanisms were significantly decreased by BDNF pre-incubation. Furthermore, proteasome and calpain inhibitors were unable to mimic the protective effect of BDNF and caspase inhibition in preventing chromatin condensation. Conversely, proteasome and calpain inhibition did protect the neuronal markers for dendrites (MAP-2), axons (Neurofilament H) and the vesicular glutamate transporters (VGLUT1 and VGLUT2), whereas caspase inhibition failed to mimic the protective effect of BDNF on neurites and synaptic markers. BDNF also partly prevented the downregulation of synaptic activity measured by the KCl-evoked glutamate release using a FRET glutamate nanosensor. Moreover, PLC¿ chemical inhibitors significantly blocked the protective action of BDNF, suggesting an activity-dependent mechanism of neuroprotection. Thus, we hypothesize that neuronal repair after a degenerative insult may start at the synaptic level and BDNF most likely induces recovery through reactivation of mechanisms of synaptic plasticity involving de novo protein synthesis (Please refer to chapter 2). The hypothesis above was assessed testing the effect of BDNF on VGLUT expression as an experimental paradigm. Exogenous application of BDNF to cultured hippocampal neurons at DIV7 (days in vitro) rapidly increased VGLUT2 mRNA and protein levels, in a dose-dependent manner, while VGLUT1 expression was only transiently increased. However, at DIV14, BDNF stably increased VGLUT1 expression, whilst VGLUT2 levels remained low. Transcription and translation inhibition fully blocked BDNF-induced VGLUT upregulation. Fluorescence microscopy imaging upon BDNF incubation showed a transient upregulation of VGLUT1 axonal trafficking and redistribution of VGLUT2-positive vesicles. These results suggest that BDNF may also affect VGLUTs subcellular distribution during development. Moreover, inhibition of TrkB receptors and PLC¿ signaling precluded BDNF-induced VGLUT upregulation, suggesting that BDNF regulates VGLUT expression during development and its effect on VGLUT1 may contribute to enhance glutamate release in LTP (Please refer to chapter 3). Overall, these results indicate that BDNF neuroprotection is not restricted to the cell soma and attenuation of caspase activation, also significantly protecting neurons from the excitotoxicity-induced damage to axons, dendrites and synapses, which predominantly results from calpain activation and increased protein ubiquitination. Furthermore, BDNF activates overlapping mechanisms under physiological and pathological conditions. BDNF concomitantly promotes connectivity between neurons and neuroprotection, by attenuating proteolytic mechanisms and/or inducing de novo expression of key neuronal markers, namely VGLUT1 and VGLUT2. Thus, we propose that reactivating BDNF-mediated developmental mechanisms of neuronal plasticity may enable to attenuate neuronal damages. BDNF may decrease proteolytic activation and/or induce recovery of hippocampal neurons under conditions of neurodegeneration.

[ES] Factor neurotrófico derivado del cerebro ( BDNF ) es una proteína pro-supervivencia , altamente expresado en el hipocampo , con funciones críticas en neuronas tanto en desarrollo como adultos . BDNF se une preferentemente a los receptores TrkB de activación , en paralelo , las vías de señalización Ras - ERK , PI3K/AKT y PLCgamma . En condiciones fisiológicas , el BDNF regula varios mecanismos de plasticiy sináptica . En condiciones patológicas , el BDNF protege las neuronas del hipocampo de la excitotoxicidad del glutamato y la isquemia . Sin embargo , los mecanismos moleculares precisos BDNF desencadena la activación del receptor TrkB para inducir la protección y / o recuperación neuronal no se entienden completamente . Este estudio trata de abordar estas cuestiones y de estudiar en profundidad la posible relación entre los mecanismos inducidos por el BDNF de la neuroprotección y / o la recuperación y mecanismos de plasticidad sináptica. En la primera parte de este estudio se analizaron las alteraciones moleculares inducida por excitotoxicidad , centrándose en la regulación a la baja de la descarboxilasa del ácido glutámico , lo que probablemente afecta a la transmisión sináptica inhibitoria. Hemos encontrado que la estimulación excitotóxica de las neuronas del hipocampo en cultivo con glutamato conduce a una escisión N-terminal dependiente del tiempo de las isoformas de la decarboxilasa del ácido glutámico GAD65 y GAD67 , a la ubiquitinación y la degradación de una pareja de unión desconocido por el proteasoma . La distribución puntiforme característico de GAD65 junto neuritas de neuronas del hipocampo en cultivo diferenciadas y actividad total GAD medidos en el cerebelo o extractos de corteza cerebral se redujo significativamente . Los resultados mostraron que la desregulación de los GAD en condiciones de excitotoxicidad , que muy probablemente afecta la neurotransmisión GABAérgica , sobre la actividad de UPS, además de otros sistemas proteolíticos implicados previamente en la excitotoxicidad inducida por glutamato ( Consulte el capítulo 1 ) . A continuación, evaluaron además la activación diferencial de los tres principales mecanismos proteolíticas ( UPS, calpaínas y caspasas ) implicados en la excitotoxicidad . Hemos tratado de estudiar el efecto protector de BDNF en diferentes compartimentos neuronales y puntos de tiempo hacia la comprensión mejor de la activación espacio-temporal de mecanismos inducidos por el BDNF de la neuroprotección . Estos resultados mostraron una activación dependiente del tiempo de proteasas y la segregación espacial de estos mecanismos . Activación de calpaína fue seguido por la desregulación del proteasoma , en las terminales sinápticas y los procesos neuronales. La activación de caspasa subsequetly se produjo en el cuerpo celular y todos los mecanismos proteolíticos se redujo significativamente por el BDNF de pre-incubación . Además , los inhibidores del proteasoma y de calpaína no fueron capaces de imitar el efecto protector de BDNF y la inhibición de la caspasa en la prevención de la condensación de la cromatina . A la inversa , la inhibición del proteasoma y calpaína protegió los marcadores neuronales para dendritas (MAP - 2 ) , los axones ( neurofilamentos H) y los transportadores de glutamato vesicular ( VGLUT1 y VGLUT2 ) , mientras que la inhibición de la caspasa no para imitar el efecto protector de BDNF en las neuritas y sináptica marcadores. BDNF también impidió en parte la regulación a la baja de la actividad sináptica medida por la liberación de glutamato evocada por KCl utilizando un nanosensor glutamato FRET . Además, los inhibidores químicos de PLC ¿ comandos significativamente la acción protectora de BDNF , lo que sugiere un mecanismo dependiente de la actividad de la neuroprotección . Por lo tanto , la hipótesis de que la reparación neuronal después de una agresión degenerativa puede comenzar en el nivel sináptico y BDNF muy probablemente induce la recuperación a través de la reactivación de los mecanismos de plasticidad sináptica que involucran la síntesis de novo de proteínas ( Por favor, consulte el capítulo 2 ) . La hipótesis anterior se evaluó probar el efecto del BDNF sobre la expresión de VGLUT como un paradigma experimental . Aplicación exógena de BDNF en las neuronas del hipocampo en cultivo en DIV7 ( días in vitro ) aumentó rápidamente ARNm VGLUT2 y los niveles de proteína , de una manera dependiente de la dosis , mientras que la expresión VGLUT1 se incrementó sólo transitoriamente . Sin embargo, en DIV14 , BDNF aumenta de manera estable expresión VGLUT1 , mientras que los niveles VGLUT2 mantuvieron bajas . La transcripción y la inhibición de la traducción comandos totalmente inducida por el BDNF - VGLUT regulación al alza . De imágenes de microscopía de fluorescencia tras la incubación BDNF mostraron una regulación al alza transitoria de VGLUT1 tráfico axonal y la redistribución de las vesículas VGLUT2 - positivo. Estos resultados sugieren que el BDNF también puede afectar VGLUTs distribución subcelular durante el desarrollo . Por otra parte , la inhibición de los receptores TrkB y la señalización del PLC ¿ impidieron inducida BDNF - VGLUT regulación al alza , lo que sugiere que el BDNF regula la expresión VGLUT durante el desarrollo y su efecto sobre VGLUT1 puede contribuir a mejorar la liberación de glutamato en la LTP ( Por favor, consulte el capítulo 3 ) . En general , estos resultados indican que el BDNF neuroprotección no se limita al soma celular y la atenuación de la activación de caspasas , que también protege significativamente las neuronas del daño inducido por excitotoxicidad - a los axones , dendritas y sinapsis, que predominantemente resulta de la activación de la calpaína y el aumento de la ubiquitinación de proteínas . Además , el BDNF activa los mecanismos superpuestos bajo condiciones fisiológicas y patológicas . BDNF promueve simultáneamente la conectividad entre las neuronas y neuroprotección, atenuando los mecanismos proteolíticos y / o inducir la expresión de novo de marcadores neuronales clave, a saber VGLUT1 y VGLUT2 . Por lo tanto , proponemos que la reactivación de los mecanismos de desarrollo mediadas BDNF de la plasticidad neuronal puede permitir atenuar daños neuronales. BDNF puede disminuir la activación proteolítica y / o inducir la recuperación de las neuronas del hipocampo en condiciones de neurodegeneración.