Optimización y análisis crítico del estudio de la monotorización de enfermedad mínima residual mediante ASO RQ:PCR en pacientes con mieloma múltiple. Comparación con la citometría de flujo

Abstract

[EN] In patients with multiple myeloma ( MM) , the quality of response to treatment has been shown to have prognostic value , so that today the complete response (CR ) represents a therapeutic target in all MM schemes . However, we know that the current response criteria are suboptimal , since they are based on low sensitivity techniques such as immunofixation and morphology. Several studies indicate that immunophenotypic and molecular techniques are more sensitive and allow assessing minimal residual disease (MRD ) in bone marrow (BM ) , so that a better quality of response would be associated with longer survival. In the molecular field , strategies based on the use of specific primers and probes to quantify a patient and the tumor mass (ASO RQ- PCR ) has shown clinical value in patients with MM . Since the applicability of the same low, we consider first objective of this thesis improve its applicability , the search for new molecular markers and / or the use of samples enriched in plasma cells by CD138 + selection . Of molecular markers used in MM , VDJH somatic mutations frequently occurs and is detected only DJH in 60 % of patients . Alternatively, the Kappa deleting element rearrangements ( Kde ) are detected in all lymphoproliferative lambda B and 1/3 of the kappa and somatic mutations have not compromise the efficiency of primers and probes . Therefore, as in acute lymphoblastic leukemia , may be successfully used as markers for EMR in MM . This rearrangement studied in 96 patients with MM and found that is detected in 50 % of them , which can be easily sequenced and no somatic mutations. Then analyze its value as an additional marker in MM and saw EMR increases the applicability of these studies in 9% of cases overall and in 20 % of cases of MM lambda group that would be a significant advance . Then investigated using samples enriched MO plasma cells by immunomagnetic selection CD138 + as a material for obtaining molecular markers of EMR by PCR in MM . For this, of the 25 samples analyzed, a part was subjected to CD138 + immunomagnetic selection and the rest , not processed , was used as control. In both sample groups try to identify three molecular targets : VDJH , DJH and Kde . Seen that the use of selected samples increased from 60% to 96 % the proportion of cases with at least one molecular marker is available at the time of diagnosis . Its use , therefore, increase the applicability of such studies. The second objective of the thesis, we propose identifying problems responsible for failures in each of the steps in the molecular study of EMR following the recommendations of the European Group Euro - MRD , standardized but not in MM . Also, take advantage of this prospective study to compare the results of molecular techniques against immunophenotypic , in order to determine which of the two is ideal for monitoring in MM EMR . ASO saw RQ -PCR enabled monitoring of the EMR only in 42 % of patients due to pre- analytical problems responsible for a 28 % loss and post- analytical , 30% of them. In a series of 103 evaluable cases , we found that the quantification of MRD in patients with MM by ASO RQ -PCR allows monitoring the effectiveness of treatment and demonstrated to have prognostic value , stratifying patients into groups with different risk of progression. When we compare both techniques , we found that while the ASO RQ -PCR has a slightly higher sensitivity, the applicability of the CMF ( > 90 % ) is significantly higher. Therefore, the CMF is to be considered the technique of choice for monitoring EMR in MM .

[ES] En pacientes con mieloma múltiple (MM), la calidad de la respuesta al tratamiento ha demostrado tener valor pronóstico, de manera que hoy en día la respuesta completa (RC) representa un objetivo en todos los esquemas terapéuticos de MM. Sin embargo, sabemos que los criterios actuales de respuesta son subóptimos, ya que se basan en técnicas de baja sensibilidad, como la inmunofijación y la morfología. Diversos estudios indican que las técnicas inmunofenotípicas y moleculares tienen mayor sensibilidad y permitirían evaluar la enfermedad mínima residual (EMR) en médula ósea (MO), de manera que una mejor calidad de la respuesta se asociaría con mayor supervivencia. En el campo molecular, las estrategias basadas en el uso de primers y sondas específicos de paciente y que permiten cuantificar la masa tumoral (ASO RQ-PCR) han demostrado valor clínico en pacientes con MM. Dado que la aplicabilidad de las mismas en baja, nos planteamos como primer objetivo de esta tesis mejorar su aplicabilidad, con la búsqueda de nuevos marcadores moleculares y/o el uso de muestras enriquecidas en células plasmáticas mediante selección CD138+. De los marcadores moleculares empleados en MM, VDJH presenta con frecuencia mutaciones somáticas y DJH se detecta sólo en 60% de los pacientes. Como alternativa, los reordenamientos de Kappa deleting element (Kde) se detectan en todos los síndromes linfoproliferativos B lambda y en 1/3 de los kappa y no presentan mutaciones somáticas que comprometan la eficiencia de primers y sondas. Por ello, al igual que en leucemia linfoblástica aguda, podrían usarse con éxito como marcadores de EMR en MM. Estudiamos este reordenamiento en 96 pacientes con MM y vimos que se detecta en 50% de los mismos, que se puede secuenciar fácilmente y que no presenta mutaciones somáticas. Analizamos luego su valor como marcador adicional de EMR en MM y vimos que aumenta la aplicabilidad de estos estudios en un 9% de los casos en general y en 20% de los casos de MM lambda, grupo en el que supondría un avance significativo. Investigamos después el uso de muestras de MO enriquecidas en células plasmáticas mediante selección inmunomagnética CD138+ como material para la obtención de marcadores moleculares de EMR mediante PCR en MM. Para ello, de las 25 muestras analizadas, una parte se sometió a selección inmunomagnética CD138+ y el resto, no procesado, se usó como control. En ambos grupos de muestras intentamos identificar 3 dianas moleculares: VDJH, DJH y Kde. Vimos que el uso de muestras seleccionadas incrementa de 60% a 96% el porcentaje de casos con al menos un marcador molecular disponible en el momento del diagnóstico. Su uso, por tanto, incrementaría la aplicabilidad de tales estudios. Como segundo objetivo de la tesis, nos planteamos identificar los problemas responsables de los fallos en cada uno de los pasos del estudio molecular de EMR siguiendo las recomendaciones del grupo europeo Euro-MRD, estandarizadas pero no en MM. Además, aprovechamos este estudio prospectivo para comparar los resultados de las técnicas moleculares frente a las inmunofenotípicas, con el fin de determinar cuál de las dos es la idónea para la monitorización de EMR en MM. Vimos que la ASO RQ-PCR permitía el seguimiento de la EMR sólo en 42% de los pacientes debido a problemas pre-analíticos, responsables de un 28% de las pérdidas y post-analíticos, de un 30% de las mismas. En una serie de 103 casos evaluables, comprobamos que la cuantificación de la EMR en pacientes con MM mediante ASO RQ-PCR permite monitorizar la eficacia de los tratamientos y demuestra tener valor pronóstico, estratificando a los pacientes en grupos con diferente riesgo de progresión. Cuando comparamos ambas técnicas, vimos que mientras que la ASO RQ-PCR tiene una sensibilidad ligeramente más alta, la aplicabilidad de la CMF (>90%) es significativamente superior. Por ello, la CMF ha de considerarse la técnica de elección para la monitorización de EMR en MM.