Desarrollo de nuevos sistemas para el cambio de escala en cromatografía de afinidad

Abstract

[ES] Dentro de los procesos downstream de separación de proteínas, la cromatografía de afinidad con metales inmovilizados es una técnica muy utilizada porque el coste es relativamente más bajo que la cromatografía de afinidad convencional y por la posibilidad de llevar a cabo el proceso a escala industrial. Tradicionalmente, estos procesos de separación de biomoléculas, se llevan a cabo en columnas empaquetadas con material en forma de partículas porosas. Sin embargo este tipo de matrices presentan inconvenientes al llevar los procesos de separación a nivel industrial, debido a que presentan una alta pérdida de carga, obligando a diseñar columnas de gran diámetro y altura reducida. Es por esta razón, que el objetivo de este trabajo es desarrollar una nueva forma de separación de proteínas basada en la técnica IMAC, utilizando como matriz cromatográfica un monolito cerámico multicanal, que permita el paso de la fase líquida que contiene la biomolécula a separar a través de los canales del mismo facilitando el movimiento dentro del soporte y disminuyendo considerablemente la pérdida de carga. Como sistema inicial de estudio, se propuso un monolito cerámico recubierto con agarosa tipo D-5, activado con 1,4 butanodiol-diglicidil-éter como brazo espaciador, ácido iminodiacético (IDA) como agente quelante y Cu2+ como ligando. Asimismo, la proteína tipo empleada para establecer las condiciones del proceso fue el suero de albúmina bovina (BSA). Posteriormente se estudió el proceso de adsorción de la enzima catalasa (CAT), para finalmente llevar a cabo la separación de una mezcla binaria (BSA+CA). Los objetivos de este trabajo se centraron en primer lugar en la determinación de la eficiencia de la matriz cromatográfica, es decir, el monolito cerámico recubierto de agarosa D5 y activado, debido a que es un factor clave para la economía del proceso de adsorción. Para este fin, la eficiencia de los ciclos de adsorción fueron determinados mediante el desarrollo de un modelo dinámico, que estudia la reutilización óptima del soporte cerámico. En primer lugar se estudió el proceso de adsorción de la proteína BSA en solución fosfato pH 4,5, a cinco caudales (1,50, 5,50, 8,40, 10,60 y 14,00 cm3/min), llevando a cabo cinco ciclos de adsorción/elución, utilizando una misma matriz monolítica. De este estudio se pudo comprobar que, utilizando un mismo caudal en el proceso de adsorción, el tiempo necesario para que el sistema alcanzara el equilibrio, era prácticamente el mismo en todos los ciclos. También se observó, que a medida que aumentaba el caudal en el proceso de adsorción, el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio era menor y que a medida que aumentaba el caudal, la capacidad de adsorción de la columna monolítica también aumentaba. Los experimentos de elución, se llevaron a cabo por medio de un agente competitivo, el imidazol donde se obtuvo un porcentaje de recuperación de proteína enlazada específicamente, en torno al 95%. Y después del proceso de elución, la columna monolítica es acondicionada para el siguiente ciclo de adsorción por medio de un lavado con tampón tris-HCl pH 8,0. Una vez estudiado el proceso de adsorción de la proteína BSA en solución fosfato pH 4,5, y determinado que el caudal de 14,00 cm3/min, era el que mejor resultado presentaba en cuanto a tiempo de equilibrio y cantidad de proteína adsorbida para las condiciones de trabajo propuestas, se procedió a estudiar el efecto del pH, llevando a cabo el proceso de adsorción de la proteína BSA en tampón fosfato pH 7,0. Así, de forma general se pudo establecer que independientemente del pH utilizado, a un caudal de 14 cm3/min, el tiempo necesario para que el proceso de adsorción alcance el equilibrio es prácticamente el mismo, y que la capacidad de adsorción de la matriz es ligeramente mayor con respecto a los experimentos en solución fosfato pH 4,5 a un caudal de 14,00 cm3/min respectivamente.