Importancia de la plasticidad del anillo de septinas en la biología de C. albicans

Abstract

[ES] Candida albicans es un hongo pleomórfico dado que posee la habilidad de crecer en tres morfologías bien definidas: levaduras, pseudohifas e hifas. Las levaduras son formas redondeadas unicelulares que se dividen por gemación y se separan al finalizar la citoquinesis. Las hifas son estructuras multicelulares que presentan un crecimiento hiperpolarizado dando lugar a filamentos en los que sus paredes laterales se mantienen paralelas a nivel del septo. Las pseudohifas se presentan como una forma intermedia entre levaduras e hifas y se caracterizan por presentar constricciones en los planos de división de los diferentes compartimentos celulares y por crecer de forma ramificada (Sudbery et al., 2004). Las septinas son una familia de proteínas que unen GTP, presentes en células eucariotas (excepto en plantas) en las que desempeñan funciones esenciales. Estas proteínas se ensamblan en estructuras de orden superior (filamentos, anillos) y funcionan como andamios moleculares para la unión de otras proteínas y como barreras de difusión. En C. albicans existen cinco septinas Cdc3, Cdc10, Cdc11, Cdc12 y Sep7 que polimerizan en filamentos (Cao et al., 2007; Lindsey y Momany, 2006; Pan et al. 2007). La disposición más general de las septinas para formar filamentos son heterotetrámeros que interactúan generándose octámeros no polares con la siguiente estructura: Sep7/Cdc11-Cdc12-Cdc3-Cdc10-Cdc10-Cdc3-Cdc12-Sep7/Cdc11 (Bertin et al., 2008). Finalmente, la unión de varios octámeros a través de las subunidades dispuestas en los extremos conduce a la formación de estructuras de orden superior denominados filamentos (Mino et al., 1998). Por otro lado, se sabe que las modificaciones post-traduccionales que sufren las septinas determinan su afinidad para incorporarse a los extremos de los octámeros. Así, en S. cerevisiae se ha comprobado que las septinas se modifican por SUMOilación, acetilación y fosforilación, y que éstas tienen efecto en su ensamblaje y función. De todas ellas, la fosforilación es la modificación mejor caracterizada y más abundante en C. albicans (Hernández-Rodríguez y Momany, 2012). Se conoce que el ensamblaje y desensamblaje de las estructuras está regulado por numerosas quinasas y fosfatasas, entre ellas las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs), Cdc28, así como Cla4 y Gin4. Además se ha demostrado que en C. albicans la inhibición de la separación celular en hifas depende de Sep7 y de su fosforilación por Cdc28-Hgc1. En consonancia con lo anterior, en S. cerevisiae se ha descrito que la septina Shs1, homóloga a CaSep7, es la que más modificaciones por fosforilación sufre (Egelhofer et al., 2008; García et al., 2011) y en estudios recientes se ha sugerido que la fosforilación en el extremo C-terminal regula negativamente la formación del collar.

Estudios previos de nuestro grupo indicaban que los anillos de septinas en levaduras e hifas presentan diferentes propiedades. Por ejemplo, la inhibición de la separación celular de las hifas depende de Sep7, ya que en un mutante ∆sep7/∆sep7 las hifas se separan (González-Novo, A. et al., 2009). Dado que C. albicans es un organismo diploide, es posible utilizar mutantes heterozigóticos para estudiar la contribución de cada septina en las propiedades y funciones del anillo. Usando esta aproximación se construyeron varios mutantes que arrojaron luz sobre este tema. En primer lugar, comprobamos que el heterocigótico simple SEP7/∆sep7 (es decir, que posee una única copia funcional de SEP7 en el genoma) presenta un fenotipo de separación celular intermedio entre el mutante nulo y el silvestre durante el crecimiento hifal. Y en segundo lugar, el doble heterocigótico SEP7/∆sep7 CDC11/∆cdc11 revierte el fenotipo del heterocigótico simple SEP7/∆sep7. Esto sugiere que la abundancia relativa de Sep7 y Cdc11 podría estar implicada en el control de la inhibición de la separación celular en hifas.

Otra pregunta sin resolver es qué determina la mayor afinidad de Sep7 o Cdc11 por Cdc12 y qué consecuencias biológicas tendría para la célula el contener unos octámeros u otros en el anillo de septinas. Se había demostrado mediante estudios in vivo que los octámeros formados durante el crecimiento levaduriforme estaban compuestos por la misma proteína a ambos extremos, es decir, estaban formados únicamente por Cdc11 o por Sep7 a ambos lados del filamento, constituyendo una estructura no polar (Ong, K. et al., 2014). Además se sabía que cuando Shs1 sustituye a Cdc11 en el extremo cambia la curvatura del bastón (Hernández-Rodríguez y Momany., 2012). Sin embargo, a cerca de la composición de los bastones durante el crecimiento filamentoso aún no hay nada descrito. Para estudiar la composición de los octámeros, se separaron los bastones según su peso molecular en gradientes de sacarosa. Se observó una distinta migración de los octámeros en levaduras e hifas, indicando diferencias en su composición y/o distinta interacción con otras proteínas. Es decir, las proporciones de los octámeros homodiméricos (constituidos por solo Cdc11 o Sep7 en ambos extremos) frente a los heterodiméricos (bastones mixtos de Sep7 en un extremo y Cdc11 en otro) podrían variar en función del tipo de crecimiento. Para abordar esta cuestión, se llevaron a cabo ensayos de co-inmunoprecipitación de los octámeros ya purificados, pero no se pudo comprobar que existiera una población siginificativa de octámeros mixtos (2% del total), y era similar en ambos tipos de crecimiento.

Dado que la principal diferencia entre Sep7 y Cdc11 reside en la región C-terminal, que es mucho mayor en Sep7, se realizó un análisis de esta región de Sep7 construyendo deleciones progresivas y analizando los fenotipos de las hifas. Los resultados indicaron que la región de Sep7 que controla la inhibición de la separación celular en hifas se localiza entre las posiciones 394 y 522. Además, mediante análisis de espectrofotometría de masas de Cdc11 y Sep7 se determinó que ambas septinas sufren modificaciones por fosforilación, presentando Sep7 muchos más sitios fosforilados. Además, en el caso de Sep7 existen aminoácidos que son fosforilados durante el crecimiento levaduriforme, filamentoso o en ambos tipos y que se agrupan en varias regiones de la proteína. Es interesante que uno de estos clusters se localiza en la región 394-522, lo que sugiere que la función de esta región en la inhibición de la separación celular podría estar regulada por fosforilación.

Otra de las regiones fosforiladas de Sep7 específicamente durante el desarrollo hifal es el extremo N-terminal, en la que se localizan dos Ser posicionadas justo antes de la hélice α0. Esta hélice es esencial para la polimerización de los octámeros en estructuras. Por ello, se construyeron mutantes fosfodeficientes y fosfomiméticos de estas posiciones (Sep7-2A y Sep7-2E respectivamente) y se observó que tienen efectos contrarios en inhibir la separación celular en las hifas. Esto está en consonancia con la idea de que las distintas modificaciones post-traduccionales, sobre todo de Sep7, podrían determinar las propiedades de los monómeros de septinas para incorporarse al anillo y desempeñar su función según el tipo de crecimiento.