Resumen de tesis. Análisis funcional de dos b-galactosidasas de cicer arietinum (biii-gal y biv-gal) y tres b-galactosidasas de la subfamilia a1 de arabidopsis thaliana (atbgal2, atbgal4 y atbgal12)

Abstract

[ES] El desarrollo vegetal depende de la interacción de numerosos procesos en los que participan diferentes proteínas. Las ß-galactosidasas se caracterizan por su capacidad de hidrolizar residuos ß-D-galactosil en el extremo no reductor de carbohidratos, glicoproteínas y galactolípidos. Estas enzimas están implicadas en el crecimiento, senescencia, defensa y maduración de frutos, entre otros procesos, debido a sus acción en los polisacáridos no celulósicos de la pared celular. Las ß-galactosidasas vegetales se encuentran codificadas por familias multigénicas. En A. thaliana se han identificado 17 ß-galactosidasas, 6 de las cuales se han agrupado en la subfamilia a1 (AtBGAL1, 2, 3, 4, 5 y 12). Se ha propuesto que esta subfamilia se localiza en la pared celular y sus promotores presentan actividad diferencial, lo que puede indicar diferentes funciones en la fisiología de la planta, aunque su función exacta se desconoce. En C. arietinum, se han descrito 4 miembros de la familia de ß-galactosidasas (ßI-Gal, ßIII-Gal,¿ßIV-Gal y¿ßV-Gal), que poseen un alto grado de similitud con la subfamilia a1 de A. thaliana. Se ha encontrado que las ß-galactosidasas de garbanzo poseen funciones diferentes en la planta, siendo la ßIII-Gal la responsable del proceso autolítico en las paredes celulares de garbanzo actuando en las cadenas laterales de ß-(1-4)-galactano del ramnogalacturonano I. Con estos antecedentes, nuestro objetivo principal fue profundizar en el estudio de la función de las ß-galactosidasas en el crecimiento vegetal. Concretamente nos centramos en las ß-galactosidasas ßIII-Gal y¿ßIV-Gal de C. arietinum y las ß-galactosidasas AtBGAL2, AtBGAL4 y AtBGAL12, ya que estas ß-galactosidasas de ambas especies poseen similitud de secuencia y podrían ser ortólogos funcionales. Para determinar la función de las ß-galactosidasas ßIII-Gal y¿ßIV-Gal se generaron plantas transgénicas de inserción única y en homocigosis bajo la acción del promotor fuerte y constitutivo p35S. Análisis fenotípicos morfológicos mostraron un retraso en el crecimiento en la línea 35S::ßIII-Gal, siendo evidente desde estadios tempranos del desarrollo, donde el peso fresco y seco de plántulas de 10 días fue claramente inferior que en plántulas tipo silvestre de la misma edad. Esta alteración fenotípica también fue evidente en plantas adultas, donde el diámetro de la roseta y la longitud del tallo floral fue menor en las plantas transgénicas cuando se compararon con el tipo silvestre. Además, el análisis estructural de los polisacáridos de la pared celular de plántulas de 3 días crecidas en condiciones de día largo como en oscuridad continua se realizado por espectroscopía FTIR mostró un descenso de galactano que se vio compensado con un aumento de ácido galacturónico y xiloglucano en las plantas que sobreexpresan la ßIII-Gal. Este resultado se confirmó con trabajos de inmunolocalización utilizando anticuerpos específicos, LM5 (específico de galactano) y LM18 (que reconoce el homogalacturonano parcialmente metilesterificado), donde se encontró una reducción del marcaje con el anticuerpo LM5 en tejidos específicos de las plantas transgénicas como el parénquima cortical del primer entrenudo (donde ha cesado el crecimiento) y el mesófilo foliar (2º par de hojas de roseta de 17 días, que se encuentran en expansión). El anticuerpo LM18, por el contrario, mostró un claro aumento del marcaje en las plantas que sobreexpresan la ßIII-Gal, concretamente en el tejido vascular y parenquima cortical del primer y tercer entrenudo y el mesófilo foliar del 2º par de hojas de roseta de 17 días. Todos estos resultados parecen indicar que la ßIII-Gal modifica las paredes celulares de arabidopsis, donde se produce una pérdida de restos galactosil que se ve compensado con un aumento del homogalacturonano y xiloglucano. Los análisis realizados anteriormente también se aplicaron a las plantas transgénicas que sobreexpresan la ßIV-Gal. Sin embargo en estas plantas no se obtuvieron variaciones que las diferenciara del tipo silvestre y que permitiera conocer su función. Para determinar la función de las ß-galactosidasas AtBGAL2, 4 y 12 se utilizaron mutantes knockout para cada una de ellas. El estudio de los 3 mutantes mostró que las paredes celulares de A. thaliana presentan capacidad autohidrolítica, sin embargo ninguna de las 3 ß-galactosidasas es la responsable de dicho proceso. Análisis realizados con los extractos proteicos de las paredes celulares de los 3 mutantes mostraron que los 3 mutantes mostraron que las ß-galactosidasas son capaces de hidrolizar sustratos artificiales como p-nitrofenil-galactosido. Los mutantes bgal2 y bgal4 presentaron niveles más altos de actividad cuando estos se compararon con sus respectivos tipos silvestres lo que podría indicar fenómenos de compensación dentro de la familia. Ninguno de los tres mutantes mostró alteraciones morfológicas en ninguno de los órganos y tejidos analizados a lo largo del desarrollo, ni alteraciones en la composición de la pared celular ni en los niveles de galactano. Tampoco se encontraron modificaciones en los polisacaridos de la pared celular cuando se analizaron las paredes celulares de plántulas de 3 días de cada mutante respecto a sus respectivos tipos silvestres cuando se analizaron por espectroscopia FTIR. Los niveles de transcritos de cada uno de los miembros de la subfamilia a1 presentaron diferencias a lo largo del desarrollo. AtBGAL1, 3 y 4 mostraron los niveles más altos de la subfamilia tanto en plántulas como en plantas. Cabe destacar los niveles de transcrito de AtBGAL4 en planta, que fueron elevados en órganos donde había finalizado su desarrollo como es el caso del primer par de hojas y la raíz de 17 días, el primer entrenudo y la flor abierta y disminuyeron drásticamente cuando los órganos se encontraban en crecimiento activo, tal y como se pudo observar en el 2º y 3º par de hojas de la roseta de 17 días, el 3º entrenudo en crecimiento activo, botón floral y silicua joven. Por el contrario AtBGAL12 presentó los niveles más bajos, siendo esta característica constante a lo largo del desarrollo. Finalmente, los niveles de transcritos de AtBGAL2 y AtBGAL5 presentaron a lo largo del desarrollo grandes fluctuaciones, aunque AtBGAL5 presento valores similares a AtBGAL12.