Desarrollo y validación de soportes macroporosos para la separación de proteínas mediante cromatografía IMAC

Abstract

[ES]Dentro de los procesos downstream de separación de proteínas, la cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC) es una técnica muy utilizada por ser una alternativa más económica que la cromatografía de afinidad, y por su facilidad de escalado. Tradicionalmente, estos procesos de separacion de biomoléculas se llevan a cabo en columnas empaquetadas con partículas porosas. Sin embargo, este tipo de matrices presenta inconvenientes a escala industrial debido a que presentan una alta pérdida de carga, lo que hace que sea necesario la utilización de columnas de gran diámetro y altura reducida. Con el fin de solventar este problema, en nuestro grupo de investigación se desarrolló un monolito cerámico recubierto de Agarosa D5, que aprovecha la resistencia mecánica del esqueleto cerámico y permite la utilización de caudales elevados sin generar problemas de pérdida de carga. Sin embargo, este monolito presenta una baja área superficial. El objetivo del presente trabajo consiste en el desarrollo y caracterización de un monolito macroporoso válido para cromatografía IMAC que tenga una elevada área superficial y permita el flujo de fluidos con caudales elevados sin generar problemas de pérdida de carga. En primer lugar, se optimizó el proceso de formación del monolito de agarosa superporosa y se caracterizó este monolito mediante un método de tratamiento de imagen utlizando el software ImageJ, con el que se estudiaron los parámetros más importantes del mismo. Los resultados obtenidos se validaron mediante la utilización de otros métodos convencionales, comprobándose que este método de tratamiento de imagen es válido. Este monolito de Agarosa Superporosa presenta buenas propiedades tales como un diámetro de Sauter de 68.63 µm que facilita el flujo convectivo, un área superficial moderadamente alta (779.53 cm2 ó 0.4884 m2 / g de monolito seco ), un valor de porosidad del 33.79±4.03% que está en concordancia con la porosidad deseada (entre 25-40%), una capacidad de swelling del 94.8 ± 2.3 %, una densidad real de 0.80 ± 0.02 g cm-3, una densidad aparente de 0.04 ± 0.03 g cm-3, un volumen de superporo de 1.50 mL y un volumen de poro no convectivo de 0.65 mL. Además, se determinó la pérdida de carga generada, la cual presenta valores muy bajos (<0.4MPa para un caudal de 50 mL/min) teniendo en cuenta las dimensiones del soporte cromatográfico y el flujo volumétrico empleado. Posteriormente, se modificó su estructura química para su utilización en cromatografía IMAC, activándose con el brazo espaciador 1,4-butanodioldiglicidiléter, y fijándose el agente quelante ácido iminodiacético (IDA) mediante un enlace covalente, y utilizándose Cu2+ como ligando. A continuación, y antes de realizar los experimentos de validación, se realizó un estudio bioinformático para predecir si se va a producir una interacción entre las biomoléculas tipo escogidas (BSA y Catalasa) y el ligando, y qué tipo de enlace se va a formar. Mediante dicho estudio, se determinó que el rendimiento de adsorción y de elución es mayor para la BSA, y que el tiempo necesario del proceso es menor. Además, se concluyó que la BSA forma enlaces sencillos con el Cu2+ inmovilizado, mientras que la Catalasa es más probable que forme enlaces dobles lo que, junto con un mayor impedimento estérico, hace que el rendimiento de elución de la BSA sea mayor que el de la Catalasa. Estos resultados se corroboraron posteriormente mediante los experimentos de adsorción-elución realizados. Se estudió la presencia de interacciones no específicas con el monolito activado y sin activar, siempre en ausencia de Cu2+ y se demostró que este monolito no presenta interacciones no específicas con la matriz. Una vez que el monolito presentaba las propiedades necesarias para su utilización en Cromatografía IMAC y que se finalizaron los estudios previos de caracterización, se validó su utilización como soporte cromatográfico utilizando BSA como proteína tipo y Catalasa como enzima utilizada habitualmente en este tipo de procesos. Con el fin de poder comparar la influencia del tipo de biomolécula en los procesos de adsorción y elución, y realizar una comparación válida entre este soporte cromatográfico y el monolito cerámico previamente utilizado en nuestro grupo, se decidió mantener constantes las condiciones experimentales empleadas. Se realizaron los experimentos de adsorción-elución de la BSA, y se determinó que este monolito ha sido reutilizado hasta 20 ciclos sin ser regenerado y con un rendimiento de adsorción constante (89.65%). El tiempo necesario para realizar el proceso de adsorción es prácticamente constante y presenta un valor de unos 75 min. La elución de la BSA se realizó utilizando un agente competitivo (imidazol), y se observó que todos los picos de elución tienen la misma forma, y el tiempo necesario para esta etapa es el mismo (unos 30 min en total). Además, utilizando un caudal de 1.5 mL/min, la cantidad de proteína recuperada se puede considerar prácticamente constante en todos los ciclos y presenta un valor de 81.93%. Se estudió la influencia del caudal de elución, determinándose que se recupera mayor cantidad de proteína hasta un valor máximo de rendimiento de elución del 99% para un caudal de 4 mL/min. Una vez finalizada la validación de la utilización de este nuevo soporte en procesos de cromatografía IMAC con BSA, se procedió a verificar su utilidad en la purificación de la enzima Catalasa, donde se realizaron ciclos de adsorción elución, a partir de los cuales se determinó que es posible utilizar el monolito durante 14 ciclos sin necesidad de regenerar el soporte. Sin embargo, teniendo en cuenta factores económicos, a partir del ciclo 14 es más rentable regenerar la columna y comenzar el proceso desde el principio. Además, las curvas de equilibrio de adsorción y el rendimiento de adsorción con el número de reusos muestran que la capacidad de adsorción permanece constante (67.02% a un caudal de 1.5 mL/min), pero que el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio aumenta con el número sucesivo de reusos (desde 80 min (n=1) hasta 150 min (n=14) para un caudal de 1.5 mL/min). Esto se podría deber a que algunos centros activos pueden no estar disponibles por la presencia de moléculas de enzima que no se han eluido de forma exitosa o a la presencia de imidazol que no ha sido retirado de forma efectiva. Por ello, al aumentar el número de reutilización, la enzima necesita más tiempo para encontrar un centro activo disponible. Por tanto, el tiempo necesario para realizar el proceso de adsorción varía con el número de reutilización entre 80 min para el primer ciclo y 150 min para el ciclo número 14, como consecuencia de la presencia de Catalasa no eluida en el ciclo anterior. Se realizó el proceso de elución de la enzima utilizando un agente competitivo (imidazol), donde se observó que, en todos los ciclos, los picos de elución tienen la misma forma, y el tiempo necesario para esta etapa es el mismo (unos 40 min en total). Utilizando un caudal de 1.5 mL/min, la cantidad de proteína recuperada se puede considerar prácticamente constante en todos los ciclos y presenta un valor de 67.39 %. Se estudió la influencia del caudal utilizado en el rendimiento de elución, determinándose que al aumentar éste se recupera mayor cantidad de proteína ya que se mejora la transferencia de materia, y el equilibrio de elución se desplaza hacia la enzima libre. El valor del rendimiento máximo de elución es de 80.02% para un caudal de 3 mL/min. Una vez finalizados los estudios de adsorción-elución con la enzima Catalasa se realizó un estudio de actividad con el fin de determinar la causa de una disminución de la misma, concluyéndose que la Catalasa no es una enzima apropiada para su purificación mediante cromatografía IMAC cuando se pretende purificar para su utilización en etapas posteriores como enzima, ya que en la etapa de elución su estructura se ve dañada de forma importante, separándose en subunidades. Sin embargo, una alternativa interesante es la inmovilización de Catalasa, ya que mejora los parámetros de la cinética enzimática respecto a los valores de la enzima libre. Una vez finalizado el estudio de adsorción-elución de estas biomoléculas en columna, se caracterizó el sistema de la columna mediante un balance de materia dinámico a cada punto de la instalación con el fin de conocer la concentración de proteína en cada momento, obteniéndose la distribución de proteína en el interior del monolito. Por último, se estudió la trasferencia de materia del proceso global de adsorción, obteniéndose los datos de resistencia a la transferencia externa ( = 0.001 s-1), interna ( = 2.507•10-3 s-1 ) y cinética ( = 8.011•10-3 s-1), concluyéndose que no hay una etapa limitante sino que la resistencia global es consecuencia de las tres resistencias. Realizando una comparación, las propiedades cromatográficas de esta nueva matriz presenta grandes mejoras en comparación con el monolito cerámico en términos de rendimiento de adsorción, cantidad de proteína total recuperada, tiempo necesario para cada etapa y número de reutilizaciones, lo que hace que sea un soporte interesante en este tipo de aplicaciones. Mediante el presente trabajo se ha demostrado la viabilidad de este monolito como soporte cromatográfico para cromatografía IMAC, fácilmente escalable y con propiedades y rendimientos mejorados y apropiados para su utilización en cromatografía preparativa.