Factores pronósticos y heterogeneidad tumoral en cáncer colorrectal esporádico. Estudio mediante técnicas morfológicas, arrays y secuenciación masiva

Abstract

[ES] El cáncer colorrectal (CCR) esporádico es la tercera neoplasia diagnosticada con mayor frecuencia en todo el mundo y la segunda causa de muerte relacionada con cáncer. La mayoría de muertes son causadas por la diseminación metastásica del tumor primario, principalmente al hígado. Estudios genéticos sugieren que el potencial metastásico radica en el propio tumor primario. Múltiples trabajos muestran que el pronóstico de la enfermedad es dependiente de ganancias y pérdidas de material genético, así como del estado mutacional de genes que participan en la vía EGFR (KRAS, NRAS, BRAF, NRAS y TP53, entre otros). También es bien sabido que las mutaciones activadoras en los genes KRAS y NRAS se asocian con una respuesta deficiente a las terapias anti-EGFR en pacientes con CCR metastásico. Además, se ha visto que aproximadamente la mitad de los pacientes con CCR con KRAS nativo no responden a estas terapias. La ausencia de respuesta al tratamiento podría deberse a que la decisión terapéutica se basa en el perfil mutacional del tumor primario, sin considerar la posibilidad de que coexistan pequeños subclones de células tumorales con mutaciones en RAS en otras muestras tumorales del paciente, ganglios linfáticos mestastásicos o en las diferentes muestras metastásicas presentes en el paciente. En base a estos antecedentes en esta tesis doctoral nos hemos planteado profundizar en el conocimiento de la heterogeneidad genética del CCR, con especial énfasis en las vías de evolución clonal presentes a nivel intra-tumoral asociadas al estado mutacional de los genes implicados en la vía de señalización EGFR, y su impacto en el comportamiento clínico y biológico de la enfermedad. Para ello, estudiamos la frecuencia y el impacto pronóstico de las mutaciones en los genes de la vía de señalización de EGFR mediante un panel customizado de amplicones para la identificación simultánea de mutaciones en los genes KRAS, NRAS (exones 2, 3 y 4), BRAF (exón 15) y TP53 (región codificante completa) utilizando técnicas de secuenciación masiva en una serie de 87 pacientes con CCR esporádico. Para el estudio de la heterogeneidad tumoral del CCR analizamos el perfil mutacional de los genes KRAS, NRAS, BRAF y PI3KCA mediante PCR específica de alelo en formato de microarrays de baja densidad en muestras pareadas de 26 tumores primarios, 16 ganglios metastásicos y 34 muestras de metástasis hepáticas procedentes de 26 pacientes con CCR metastásico no tratados (n = 76 muestras). Por último, para analizar el valor pronóstico de la expresión de las proteínas alteradas más frecuentemente en CCR estudiamos muestras correspondientes a 51 pacientes con CCR (25 tumores que desarrollaron metástasis hepáticas y 26 tumores no metastásicos, con una mediana de seguimiento de 103 meses) utilizando técnicas de IHQ. Además evaluamos la expresión y la regulación del gen EGFR empleando arrays de alta densidad (ARNm y miARNs). Para los estudios de del número de copias (CNV) del gen EGFR utilizamos arrays de SNPs de 500K y técnicas de FISH. Esta aproximación nos ha permitido profundizar en el conocimiento de la heterogeneidad genética del CCR. También identificamos marcadores genómicos que nos podrían ayudar a identificar en el momento del diagnóstico a pacientes con alta probabilidad de desarrollar metástasis.