Ingeniería metabólica en Ashbya gossypii para el desarrollo de bioprocesos industriales. Biología sintética y economía circular

Abstract

[ES] El Pacto Verde Europeo adoptado por la Comisión Europea tiene como objetivo hacer frente al cambio climático y a la degradación del medio ambiente. En este sentido, es de gran interés el empleo de materias primas renovables y el aprovechamiento de residuos generados por otros sectores e industrias como la biomasa lignocelulósica, constituida por glucosa y xilosa principalmente. En consecuencia, conseguir un uso eficiente de xilosa en fermentaciones microbianas se ha convertido en un objetivo importante en biotecnología. Ashbya gossypii es un hemiascomiceto filamentoso empleado para la producción de riboflavina y otros compuestos de interés industrial como nucleósidos, folatos y biolípidos, entre otros. Su importancia en la industria ha contribuido a su estudio y al desarrollo de herramientas moleculares para su manipulación. La ingeniería metabólica de este hongo ha permitido emplear medios de cultivo con xilosa como única fuente de carbono. Sin embargo, la construcción de diseños más complejos requiere el desarrollo de nuevas herramientas moleculares. En este contexto, se ha diseñado un sistema CRISPR/Cas9 adaptado a A. gossypii. Así, se ha comprobado la introducción eficiente de deleciones, sustituciones e inserciones de nucleótidos sin la integración genómica de marcadores de resistencia. Además, se ha llevado a cabo la caracterización de secuencias promotoras empleando del sistema Dual Luciferase Reporter (DLR). Las secuencias promotoras descritas se agrupan en tres grupos según su actividad transcripcional en promotores fuertes, medios y débiles. Adicionalmente, el sistema DLR se ha empleado para evaluar la funcionalidad de sitios reguladores pertenecientes a genes que controlan la ruta de producción de riboflavina. Por otro lado, mediante el empleo de estas herramientas y las ya existentes, se ha llevado a cabo la modificación de la ruta del mevalonato de A. gossypii para la producción de limoneno en cepas capaces de usar xilosa como única fuente de carbono. La sobreexpresión heteróloga de la limoneno sintasa de Citrus limon, junto con la sobreexpresión de los genes endógenos HMG1 y ERG12, además de la sobreexpresión de la ruta ortogonal NDPS1 ha permitido obtener una cepa de A. gossypii que produce 336.4 mg/L de limoneno en cultivos con xilosa como principal fuente de carbono. Este trabajo aporta nuevas herramientas de edición genómica de A. gossypii para la implementación de nuevas estrategias de ingeniería metabólica, como la producción de monoterpenos, demostrando la versatilidad e importancia de A. gossypii como factoría microbiana capaz de aprovechar residuos agroindustriales ricos en xilosa. [EN] The European Green Deal adopted by the European Commission contains a set of proposals aiming at combating climate change and environmental degradation. In this regard, the utilization of renewable materials and residues such as lignocellulosic biomass, composed mainly by glucose and xylose, it is of great interest. Consequently, the implementation of efficient systems for the utilization of xylose in microbial fermentations has become an important goal in biotechnology. Ashbya gossypii is a filamentous hemiascomycete that is currently exploited to produce riboflavin and other high-value compounds such as nucleosides, folates and biolipids. Its industrial relevance has promoted its research and the development of molecular tools. Therefore, the metabolic engineering of this fungus has enabled to design strains that can grow in cultures with xylose as the only carbon source. However, the construction of highly complex designs relies on the development of new methods to expand the molecular toolkit of this microbial factory. Hence, a one-vector CRISPR/Cas9 system for genomic engineering of A. gossypii has been developed. The efficiency of this genomic edition system as a marker-less approach has been validated for nucleotide deletions, substitutions, and insertions. Besides, an adaptation of the Dual Luciferase Reporter (DLR) system has been implemented for the identification of novel promoters in A. gossypii. The new promoter sequences described can be grouped into three classes according to their transcriptional activity in strong, medium, and weak promoters. In addition, the functionality of regulatory sites belonging to genes that control the riboflavin pathway has been evaluate in A. gossypii with this DLR system. Furthermore, novel strains of A. gossypii have been developed to produce limonene from xylose, through metabolic engineering of the mevalonate pathway. The overexpression of the limonene synthase from Citrus limon together with the overexpression of the endogenous HMG1 and ERG12 genes, and the overexpression of an heterologous orthogonal NDPS1 pathway triggered a limonene accumulation of 336.4 mg/L in cultures with xylose as the main carbon source. This work presents new molecular tools for A. gossypii that can help to promote new advanced strategies for the metabolic engineering of the fungus, such as the production of monoterpenes. This emerging biotechnological application highlights the importance of A. gossypii as a microbial factory that can grow on xylose-rich agro-industrial residues.