Resumen de tesis. The anti-tumor peptide Tat-Cx43266-283 Modulates the interplay between glioblastoma cells and tumor-associated astrocytes

Abstract

[ES] Los glioblastomas constituyen la forma más frecuente y agresiva de tumor cerebral. A pesar de continuos esfuerzos por encontrar una cura, el glioblastoma es considerado uno de los cánceres más mortales, con una supervivencia media de apenas 16 meses. Estos tumores se caracterizan por seguir un patrón de crecimiento rápido y agresivo, tener gran capacidad infiltrativa y ser resistentes a los tratamientos actuales. Una de las principales características de los glioblastomas es su gran heterogeneidad, conteniendo una población de células con características de célula madre (células madre de glioma o GSCs, por sus siglas en inglés), las cuales son altamente tumorigénicas y presentan alta actividad de la oncoproteína Src. La presencia de células tumorales en el cerebro desencadena la activación de los astrocitos presentes en su microambiente, condicionándolos para que contribuyan a la progresión tumoral. Previos estudios realizados en nuestro laboratorio demostraron que un péptido penetrante basado en la conexina 43 (Tat-Cx43266-283) es capaz de recrear la inhibición de Src promovida por esta proteína, ejerciendo de esta manera un potente efecto antitumoral sobre las células de glioblastoma in vitro e in vivo. Notablemente, este péptido no tiene efectos deletéreos sobre las células sanas del cerebro. En esta Tesis Doctoral, exploramos los mecanismos por los que se produce la activación de los astrocitos en el contexto del glioblastoma y analizamos el efecto de Tat-Cx43266-283 en la comunicación entre las células tumorales y los astrocitos. Primero, empleamos modelos de co-cultivo para estudiar la activación de los astrocitos in vitro y ex vivo. De esta manera, observamos que la presencia de células de glioblastoma promueve un cambio en el fenotipo de los astrocitos, caracterizado por un aumento en la fosforilación del factor de transcripción STAT3 y su traslocación al núcleo. Además, observamos que la laminina activa los astrocitos, aumentando la actividad de STAT3 y la expresión de sus genes diana N-cadherina y b-catenina. Cabe destacar que el tratamiento con Tat-Cx43266-283 revierte esta activación. Segundo, ponemos a punto un modelo de glioblastoma in vivo, en el cual inyectamos de manera singénica células madre obtenidas a partir de la línea de glioma de ratón GL261 en ratones inmunocompetentes. El tratamiento de estas células con Tat-Cx43266-283 reduce la fosforilación de Src y sus niveles totales, disminuye la proliferación y promueve la diferenciación hacia un linaje de tipo oligodendrocítico, favoreciendo el efecto anti-tumoral del quimioterapéutico empleado actualmente, la temozolomida (TMZ). Además, generamos células resistentes a Tat-Cx43266-283 y TMZ y caracterizamos su respuesta ante estos tratamientos. Tercero, nos servimos de este modelo de ratón para confirmar el efecto de Tat-Cx43266-283 sobre la activación de los astrocitos. Observamos que la progresión tumoral induce una fuerte respuesta en los astrocitos, con activación de STAT3, y que el tratamiento con Tat-Cx43266-283 revierte este efecto. Por último, realizamos estudios de célula única de alto rendimiento con el objetivo de confirmar los principales resultados de esta Tesis y obtener una visión global que nos permita una mejor comprensión de la biología del glioblastoma y dirija los pasos hacia la obtención de un tratamiento efectivo frente a estos tumores. En resumen, los resultados presentados en esta Tesis Doctoral confirman el efecto antitumoral de Tat-Cx43266-283 sobre las células de glioblastoma y descubren una nueva función de este péptido en la modulación de la activación de los astrocitos. Estos efectos tienen un notable efecto combinatorio, dando lugar a la pérdida de comunicación entre las células de glioblastoma y los astrocitos en su microambiente y comprometiendo así la progresión tumoral. [EN] Glioblastoma is the most aggressive and frequent form of primary brain tumor and, despite continuous effort to find an effective treatment, is considered as one of the deadliest types of cancer, with a median survival of only 16 months. Glioblastomas are characterized by fast and aggressive growth, high infiltrative capacity, and resistance to current treatments. These tumors are composed of a heterogeneous population of cells, including some with stem cell properties (glioblastoma stem cells, GSCs), which are highly tumorigenic and have high oncogenic Src activity. The presence of tumor cells in the brain triggers the activation of the astrocytes in the tumor microenvironment, which ultimately cooperate with glioblastoma cells to promote tumor progression. Previous results from our laboratory show that a cell-penetrating peptide that mimics the inhibitory effect of connexin43 on Src (Tat-Cx43266-283) exerts potent anti-tumoral effects in glioblastoma cells in vitro and in vivo, without deleterious effects in healthy brain cells. In this PhD thesis, we explore the mechanisms of astrocyte activation in the context of glioblastoma and analyze the effect of Tat-Cx43266-283 in the crosstalk between tumor cells and astrocytes. First, we use ex vivo and in vitro co-culture models to study astrocyte activation. We show that the presence of glioblastoma cells promotes a change in the phenotype of astrocytes that is characterized by an increase in the phosphorylation and nuclear translocation of the transcription factor STAT3. We find that laminin activates astrocytes, increasing the activity of STAT3 and the expression of its target genes N-cadherin and b-catenin. Importantly, we find that the treatment with Tat-Cx43266-283 reverts these effects. Second, we set up an in vivo model consisting in the intracranial injection of GL261 GSCs in immunocompetent syngeneic mice. We show that the treatment of GSCs derived from GL261 with Tat-Cx43266-283 reduces Src levels and activity, diminishes proliferation, and promotes differentiation towards an oligodendrocyte-like state that favors temozolomide (TMZ) anti-tumor effect. We generate drug resistant GL261 GSCs and characterize their response to Tat-Cx43266-283 and TMZ treatments. Third, we use the in vivo model to confirm the effect of Tat-Cx43266-283 on astrocyte activation. We find that tumor progression induces a vast response of astrocytes, including STAT3 activation, and that Tat-Cx43266-283 reverts this effect. Finally, we take advantage of high-throughput single-cell technologies to confirm the main findings of this PhD Thesis and obtain a global picture that helps understanding glioblastoma biology and, ultimately, provide a cure for this deadly malignancy. In summary, the results presented in this PhD Thesis confirm the anti-tumor effect of Tat-Cx43266-283 in glioblastoma cells and uncover a new role for this peptide in the modulation of astrocyte activation. The combination of these effects disrupts the cross-communication between glioblastoma cells and astrocytes, contributing to the reduction of tumor growth and invasion.