Resumen de tesis. Tecnología LAMP para el diagnóstico molecular adaptado de enfermedades infecciosas

Abstract

[ES] Históricamente, el progreso en el diagnóstico de enfermedades infecciosas se ha visto limitado por los requerimientos técnicos y estructurales que presentan muchas de las metodologías utilizadas. Así, tecnologías con elevada sensibilidad y especificidad, como la amplificación de ácidos nucleicos, han quedado restringidas a laboratorios de referencia con importantes infraestructuras. Por ello, infecciones endémicas en países en vías de desarrollo son las que más han sufrido este problema diagnóstico. La carencia de sistemas apropiados para la detección de patógenos ha llevado en muchas ocasiones a un sobre o infra tratamiento, a una falta de este e incluso a un tratamiento innecesario o hasta dañino. Ha resultado también en una distorsión de los datos epidemiológicos de numerosas enfermedades infecciosas. Las técnicas de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos se desarrollaron con la promesa de llevar al campo el diagnóstico molecular realizado en el laboratorio. La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP, del inglés Loop-mediated isothermal amplification) es hoy día la más utilizada entre todas ellas. Sin embargo, tras dos décadas desde su presentación, éste y otros métodos isotérmicos siguen siendo infrecuentes en la práctica clínica diaria. En este contexto, nos planteamos como hipótesis de esta Tesis Doctoral la necesidad de adaptar esta tecnología y combinarla con otras que permitan almacenar y transportar los reactivos de reacción necesarios, sin requerir una cadena de frío. También consideramos preciso disponer de dispositivos pequeños, portátiles y autónomos para llevar a cabo la reacción. Además, la amplificación convendría poder monitorizarla a tiempo real y todos los datos generados ser gestionados cómodamente a través de un dispositivo inteligente. Esta hipótesis se basó en un análisis bibliográfico detallado que se presenta como introducción. En primer lugar, se definen las generalidades de los diferentes diagnósticos basados en ácidos nucleicos, desde la PCR hasta las distintas técnicas de amplificación isotérmica y los diferentes análisis post-amplificación. Una vez establecido este marco teórico, se describen en profundidad las aplicaciones de la tecnología LAMP en las enfermedades tropicales desatendidas (NTDs, del inglés Neglected Tropical Diseases), con especial atención a la esquistosomosis y en la infección por SARS-CoV-2. En estas revisiones se destacan las fortalezas de los estudios presentados hasta la fecha y también sus limitaciones. Se establece así una hoja de ruta para las aportaciones que este trabajo de investigación puede hacer al campo de estudio. De esta manera, propusimos como objetivo general la adaptación de la tecnología LAMP para su validación como método molecular en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Para ello, se definen diversos objetivos específicos que se van alcanzando en los diferentes artículos de investigación presentados en esta Tesis Doctoral. El primer objetivo específico se basaba en desarrollar y aplicar un método de estabilización sencillo que permitiera almacenar reactivos LAMP listos para el uso a temperatura ambiente. Para ello, utilizamos el método SmMIT-LAMP, previamente publicado por nuestro grupo para la detección de ADN de Schistosoma mansoni. Con un simple proceso de desecación, obtenemos reactivos listos para el uso y estables a temperatura ambiente durante varias semanas. Como segundo objetivo específico nos planteamos diseñar y desarrollar un dispositivo portátil y una aplicación móvil, con el fin de realizar reacciones a tiempo real de amplificación isotérmica y analizar y almacenar los resultados obtenidos. Este dispositivo se materializa en el SMART-LAMP, que fue registrado como modelo de utilidad concedido en la Oficina Española de Patentes y marcas bajo el título “Dispositivo de diagnóstico de enfermedades tropicales desatendidas”. Durante la realización de esta Tesis Doctoral, estalló la pandemia provocada por SARS-CoV-2. El desarrollo de métodos de diagnóstico rápidos, sensibles y precisos se convirtió en una tarea de imperiosa necesidad en los primeros compases de la misma. Por ello, establecimos como tercer objetivo específico el diseño de diferentes ensayos RT-LAMP (Reverse transcription–LAMP) para la detección del virus y su evaluación en diversas muestras clínicas. Describimos ocho ensayos RT-LAMP diferentes para la detección de SARS-CoV-2. Además, realizamos un análisis comparativo de estos en términos de cinética, sensibilidad y especificidad y finalmente seleccionamos los mejores para su posterior aplicación en muestras clínicas. Se observó una alta sensibilidad y especificidad en muestras de exudados nasofaríngeos. Sin embargo, se comprobó que no eran útiles en muestras de orina para la detección de ARN del virus. Por otra parte, se realizaron mejoras sobre el protocolo de estabilización de los reactivos, incrementándose a dos meses su estabilidad a temperatura ambiente. El cuarto objetivo específico tuvo como finalidad evaluar la utilidad diagnóstica del dispositivo portátil SMART-LAMP. Para ello, diseñamos un estudio piloto en el que combinamos el uso del dispositivo con el método de estabilización de reactivos desarrollado, obteniendo un sistema portátil y fácil de utilizar en zonas de escasa infraestructura. Se ensayó para la detección de Schistosoma mansoni, S. haematobium, Strongyloides spp. y SARS-CoV-2, obteniendo elevados valores predictivos. Los resultados fueron comparables con los obtenidos por RT-qPCR y con un dispositivo comercial de amplificación isotérmica. En conclusión, el trabajo que aquí se presenta muestra: (i) el desarrollo de una metodología sencilla y rápida de estabilización de reactivos LAMP, que permite su almacenamiento a temperatura ambiente en un formato listo para el uso; (ii) el diseño y desarrollo de un dispositivo portátil (SMART-LAMP) que permite la realización a tiempo real de reacciones de amplificación isotérmica, controlado a través de una aplicación móvil; (iii) la puesta a punto de un RT-LAMP para la detección de SARS CoV-2 con altos valores de sensibilidad y especificidad; (iv) la aplicación del SMART LAMP para diferentes ensayos LAMP, demostrando su excelente rendimiento diagnóstico, con resultados comparables a los obtenidos con técnicas moleculares de referencia (RT-qPCR) y otros dispositivos comerciales de amplificación isotérmica. [EN] Historically, progress in the diagnosis of infectious diseases has been limited by technical and structural requirements of many of the methodologies used. Thus, highly sensitive and specific technologies, such as nucleic acid amplification, have been restricted to reference laboratories with important infrastructures. As a result, endemic infections in developing countries have suffered the most from this diagnostic problem. The lack of appropriate systems for pathogen detection has often led to over- or undertreatment, lack of treatment and even unnecessary or even harmful treatment. It has also resulted in a distortion of epidemiological data for numerous infectious diseases. Nucleic acid isothermal amplification techniques were developed with the promise of bringing molecular diagnostics performed in the laboratory to the field. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is today the most widely used of these techniques. However, two decades after its presentation, this and other isothermal methods are still infrequent in daily clinical practice. In this context, we propose as a hypothesis in this PhD Thesis the need to adapt this technology and combine it with others that allow storage and transport of the necessary reaction reagents, without a cold chain. We also consider it necessary to have small, portable and autonomous devices to carry out the reaction. In addition, amplification should be monitored in real time and all the data generated should be conveniently managed through an intelligent device. This hypothesis was based on a detailed bibliographic analysis, which is presented as an introduction. First, the generalities of the different nucleic acid-based diagnostics are defined, from PCR to the different isothermal amplification techniques and the different post-amplification analyses. Once this theoretical framework is established, the applications of LAMP technology in the different infections studied are described in depth: Neglected Tropical Diseases (NTDs), with special attention to schistosomiasis and SARS-CoV-2 infection. These reviews highlight the strengths of the studies presented to date and their limitations. Thus, we establish a roadmap for the contributions of our research can make to the field of study. Thus, we proposed as a general objective the adaptation of LAMP technology for its validation as a molecular method in the diagnosis of infectious diseases. For this purpose, several specific objectives are defined, which are achieved in the different research articles presented in this Doctoral Thesis. The first specific objective was focused on the development and application of a simple stabilization method to store ready-to-use LAMP reagents at room temperature. For this purpose, we used the SmMIT-LAMP method, previously published by our group for the detection of Schistosoma mansoni DNA. With a simple desiccation process, we obtain ready to-use reagents that are stable at room temperature for several weeks. As a second specific objective, we set out to design and develop a portable device and a mobile application, in order to perform real-time isothermal amplification reactions, and to analyze and store the results obtained. This device is materialized in the SMART LAMP, which was registered as a utility model granted at the Spanish Patent and Trademark Office under the title "Device for the diagnosis of neglected tropical diseases". During this Doctoral Thesis, the SARS-CoV-2 pandemic emerged. The development of rapid, sensitive and accurate diagnostic methods became an urgent need in the early stages of the pandemic. Therefore, we set as a third specific objective the design of different RT LAMP (Reverse transcription-LAMP) assays for the detection of the virus and their evaluation in various clinical samples. We described eight different RT-LAMP assays for the detection of SARS-CoV-2. In addition, we performed a comparative analysis of these in terms of kinetics, sensitivity and specificity, and finally selected the best ones for further application in clinical samples. This analysis in nasopharyngeal exudates demonstrated high sensitivity and specificity in the designed RT-LAMPs. It was also tested in urine samples showing that they were not useful for the detection of the virus’s RNA. Additionally, improvements were made on the reagent stabilization protocol, increasing its stability at room temperature to over two months. The fourth specific objective was to evaluate the diagnostic utility of the SMART LAMP device. To this end, we designed a pilot study in which we combined the portable device with the reagent stabilization method developed, obtaining a portable system that is easy to use in areas with limited infrastructure. It was tested against four pathogens (Schistosoma mansoni, S. haematobium, Strongyloides spp. and SARS-CoV-2) obtaining high predictive values. The results were comparable with those obtained by RT-qPCR and with a commercial isothermal amplification device. In conclusion, the work presented here shows: (i) the development of a simple and rapid methodology for the stabilization of LAMP reagents, which allows their storage at room temperature in a ready-to-use format; (ii) the design and development of a portable device (SMART-LAMP) that allows the real-time performance of isothermal amplification reactions, controlled through a mobile application; (iii) the development of an RT-LAMP for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal samples, showing high sensitivity and specificity values; (iv) the application of the SMART-LAMP for different LAMP assays, demonstrating its excellent diagnostic performance, with results comparable to those obtained with gold standard molecular techniques (RT-qPCR) and other commercial isothermal amplification devices.