The CSN3 subunit of the COP9 signalosome interacts with the HD region of Sos1 regulating stability of this GEF protein

Abstract

[EN]Sos1 es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina Ras (RasGEF) universal y ampliamente expresado en células eucariotas. Se sabe que el motivo HD de su N-terminal está involucrado en la regulación alostérica de la actividad Sos1 GEF a través de interacciones intramoleculares con el dominio PH vecino. En este trabajo buscamos otras proteínas celulares que pudieran interactuar con el dominio HD de Sos1. Utilizando un sistema de doble híbrido de levadura, identificamos la interacción entre la región HD de Sos1 y CSN3, el tercer componente del signalosoma COP9, un complejo proteico conservado de múltiples subunidades que funciona en la vía ubiquitina-proteosoma para controlar la degradación de muchas proteínas celulares. La interacción de CSN3 con la región HD de Sos1 se confirmó “in vitro” utilizando mutantes truncados mediante la asociación de dicha región con GST y fue reproducido in vivo por co-inmunoprecipitación con la proteína celular endógena Sos1 completa. Ensayos de fosforilación “in vitro” mostraron que PKD, una quinasa asociada al signalosoma COP9, es capaz de fosforilar Sos1. Los niveles intracelulares de la proteína Sos1 disminuyeron claramente después de la eliminación de CSN3 o PKD, lo que resultó en un incremento en la ubiquitinación del Sos1 endógeno en diferentes tipos de células de mamíferos. Tras la estimulación con el factor de crecimiento epidérmico, también se observó una reducción significativa en la formación de RasGTP en células silenciadas con CSN3 en comparación con las células de control. Nuestros datos sugieren que la interacción de Sos1 con el signalosoma COP9 y la PKD juega un papel importante en el mantenimiento de la estabilidad y homeostasis de las proteínas Sos1 en condiciones fisiológicas y plantea la posibilidad de considerar el complejo CSN/PKD como potencial objetivo para el diseño de nuevos fármacos terapéuticos.

[EN]Sos1 is an universal, widely expressed Ras guanine nucleotide-exchange factor (RasGEF) in eukaryotic cells. Its Nterminal HD motif is known to be involved in allosteric regulation of Sos1 GEF activity through intramolecular interaction with the neighboring PH domain. Here, we searched for other cellular proteins also able to interact productively with the Sos1 HD domain. Using a yeast two-hybrid system, we identified the interaction between the Sos1 HD region and CSN3, the third component of the COP9 signalosome, a conserved, multi-subunit protein complex that functions in the ubiquitin–proteasome pathway to control degradation of many cellular proteins. The interaction of CSN3 with the HD of Sos1 was confirmed in vitro by GST pull-down assays using truncated mutants and reproduced in vivo by co-immunoprecipitation with the endogenous, full-length cellular Sos1 protein. In vitro kinase assays showed that PKD, a COP9 signalosome-associated-kinase, is able to phosphorylate Sos1. The intracellular levels of Sos1 protein were clearly diminished following CSN3 or PKD knockdown. A sizable fraction of the endogenous Sos1 protein was found ubiquitinated in different mammalian cell types. A significant reduction of RasGTP formation upon growth factor stimulation was also observed in CSN3-silenced as compared with control cells. Our data suggest that the interaction of Sos1 with the COP9 signalosome and PKD plays a significant role in maintenance of cellular Sos1 protein stability and homeostasis under physiological conditions and raises the possibility of considering the CSN/PKD complex as a potential target for design of novel therapeutic drugs