Laser microdissection and microarray analysis of the hippocampus of Ras-GRF1 knockout mice reveals gene expression changes affecting signal transduction pathways related to memory and learning

Abstract

[ES]En este trabajo utilizamos macrodisección manual o microdisección por captura láser (LCM) para aislar secciones de tejido del área del hipocampo de cerebros de ratones knockout Ras-GRF1 y controles silvestres, y analizamos sus patrones transcripcionales utilizandomicroarrays de oligonucleótidos comerciales. Comparando los transcriptomas de macrodiseccionados y microdiseccionados, las muestras de LCM permitieron la detección de un número significativamente mayor de genes expresados diferencialmente, con tasas estadísticas de significación más altas. Estos resultados validan la LCM como una técnica fiable para estudios genómicos in vivo en el hipocampo del cerebro, donde la contaminación por áreas circundantes (que no expresan Ras-GRF1) aumenta el ruido de fondo y perjudica la identificación de genes expresados diferencialmente. La comparación entre muestras de hipocampo LCM de tipo salvaje y knockout reveló que la eliminación de Ras-GRF1 provocó cambios significativos en la expresión genética, que afectaron principalmente la transducción de señales y los procesos neuronales relacionados. La lista de 36 genes expresados de forma más diferencial incluía loci relacionados principalmente con la señalización por Ras y la organización del citoesqueleto (14-3-3gamma/zeta, Kcnj6, Clasp2) o vías de comunicación cruzada relacionadas (como jag2, decorina, correa). De acuerdo con los fenotipos mostrados por los ratones knockout para Ras-GRF1, muchos de estos genes expresados diferencialmente desempeñan funciones funcionales en procesos como el desarrollo y la función sensorial (Sptlc1, antiquitina, jag2) y/o procesos de desarrollo neurológico/neurodegeneración que afectan la memoria y el aprendizaje. De hecho, se han informado vínculos potenciales con enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA) o la enfermedad de Creutzfeldt-Jacobs (CJD) para varios genes expresados diferencialmente identificados en este estudio (Ptma, Aebp2, Clasp2, Hebp1, 14-3- 3gamma/zeta, Csnk1-delta, etc.). Estos datos, junto con el papel previamente descrito de IRS y la insulina (conocidos activadores de Ras-GRF1) en la EA, justifican una mayor investigación de un posible vínculo funcional de Ras-GRF1 con los procesos neurodegenerativos.

[EN]We used manual macrodissection or laser capture microdissection (LCM) to isolate tissue sections of the hippocampus area of Ras-GRF1 wild type and knockout mice brains, and analyzed their transcriptional patterns using commercial oligonucleotide microarrays. Comparison between the transcriptomes of macrodissected and microdissected samples showed that the LCM samples allowed detection of significantly higher numbers of differentially expressed genes, with higher statistical rates of significance. These results validate LCM as a reliable technique for in vivo genomic studies in the brain hippocampus, where contamination by surrounding areas (not expressing Ras-GRF1) increases background noise and impairs identification of differentially expressed genes. Comparison between wild type and knockout LCM hippocampus samples revealed that Ras-GRF1 elimination caused significant gene expression changes, mostly affecting signal transduction and related neural processes. The list of 36 most differentially expressed genes included loci concerned mainly with Ras/G protein signaling and cytoskeletal organization (i.e. 14-3-3γ/ζ, Kcnj6, Clasp2) or related, cross-talking pathways (i.e. jag2, decorin, strap). Consistent with the phenotypes shown by Ras-GRF1 knockout mice, many of these differentially expressed genes play functional roles in processes such as sensory development and function (i.e. Sptlc1, antiquitin, jag2) and/or neurological development/neurodegeneration processes affecting memory and learning. Indeed, potential links to neurodegenerative diseases such as Alzheimer disease (AD) or Creutzfeldt-Jacobs disease (CJD), have been reported for a number of differentially expressed genes identified in this study (Ptma, Aebp2, Clasp2, Hebp1, 14-3-3γ/ζ, Csnk1δ, etc.). These data, together with the previously described role of IRS and insulin (known Ras-GRF1 activators) in AD, warrant further investigation of a potential functional link of Ras-GRF1 to neurodegenerative processes.