Characterization and improvement of a self-assembled spindle in fission yeast meiosis

Abstract

[EN] Centrosomes are the major microtubule-organizing centres in eukaryotic cells. In mitosis and male meiosis, centrosomes nucleate and organize the microtubules that build up the spindle, the macromollecular apparatus that generates and guides the physical forces needed to segregate chromosomes into daughter cells. Contrarily, in female meiosis of most metazoa, the female progenitor cell actively eliminate centrosomes before or during meiotic divisions. Consequently, the meiotic spindle assembles and segregates chromosomes without the guidance of centrosomes (‘acentrosomal spindle’). The fission yeast Schizosaccharomyces pombe is excellent to study meiosis, although it maintains the SPBs (fungal equivalent of centrosomes) in meiosis and so, the meiotic spindle is still mediated by the SPBs in this organism (‘SPB-mediated spindle’). This difference with female metazoan meiosis limits the potential of this yeast for studying the molecular basis underlying the acentrosomal spindle, interesting to understand the meiotic errors affecting human fertility and health. In our lab, we generated a fission yeast system (bqt1Δ sad1.2) where SPBs are dislodged from the nuclear envelope, so that the SPB-dependent spindle formation is abolished. Here, we observe a microtubule array with spindle-like morphology and dynamics and chromosome segregation capability despite the dislodgement of SPBs, hypothesizing that this structure is a self-assembled spindle, independent of SPBs in fission yeast meiosis in analogy with the acentrosomal spindle independent of centrosomes in female metazoan meiosis. In this doctoral thesis, we explore the possibility of such type of spindle, optimizing the experimental conditions for its formation and study. We confirm the formation of the self-assembled spindle independently of the SPBs and validate this by reproducing it through alterative genotypes. Also, we describe that its assembly depends on the microtubule polymerizer and nucleator Alp14/XMAP215 and that the microtubule crosslinker Ase1/PRC1 is necessary to maintain its structural integrity during elongation. However, its formation is majorly independent of the γ-tubulin complex activity, instead depending on mechanisms conserved in metazoa, crutial for acentrosomal spindle formation, such as the kinetochore pathway and the RanGTP gradient. Further, we improve its structural robustness and fidelity of chromosome segregation by stabilizing microtubules via the elimination of Kinesin-8, especifically Klp6 but not Klp5. Lastly, we standarized our methodology for self-assembled spindle obention, observation through fluorescence microscopy timelapse and analysis, enabling a deeper characterization of spindle assembly, elongation dynamics and chromosome segregation. [ES] Los centrosomas son los principales centros organizadores de microtúbulos en las células eucariotas. En mitosis y meiosis masculina, los centrosomas nuclean y organizan los microtúbulos que construyen el huso, el aparato macromolecular que genera y guía las fuerzas físicas necesarias para segregar los cromosomas en las células hijas. Por el contrario, en la meiosis femenina de la mayoría de metazoos, la célula progenitora femenina activamente elimina los centrosomas antes o durante las divisiones meióticas. Consecuentemente, el huso meiótico se ensambla y segrega cromosomas en ausencia de la guía de los centrosomas (‘huso acentrosómico). La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe es excelente para estudiar la meiosis, aunque esta mantiene los SPBs (equivalentes fúngicos de los centrosomas) en meiosis y, entonces, el huso meiótico sigue siendo mediado por los SPBs en este organismo (’huso dependiente de SPB’). Esta diferencia con la meiosis femenina de metazoos limita el potencial de esta levadura para estudiar la base molecular subyacente al huso acentrosómico, interesante para entender los errores meioóticos que afectan a la fertilidad y salud humanas. En nuestro laboratorio, hemos generado un sistema de levadura de fisión (bqt1Δ sad1.2) en el que los SPBs están aislados de la envoltura nuclear, de tal forma que la formación huso dependiente de SPBs está abolida. Aquí, observamos un array de microtúbulos con una morfología y dinámicas típicas de un huso y capacidad de segregación de cromosomas a pesar del aislamiento de los SPBs, hipotetizando que esta estructura es un huso autoensamblado, independiente de los SPBs en la meiosis de la levadura de fisión, análogo al huso acentrosómico independiente de los centrosomas en la meiosis femenina de metazoos. En esta tesis doctoral, exploramos la posibilidad de dicho tipo de huso, optimizando las condiciones experimentales para su formación y estudio. Confirmamos la formación del huso autoensamblado independientemente de los SPBs y validamos esto reproduciéndola mediante genotipos alternativos. También, describimos que su ensamblaje depende del polimerizador y nucleador de microtúbulos Alp14/XMAP215 y que el entrecruzador de microtúbulos Ase1/PRC1 es necesario para mantener su integridad estructural durante su elongación. Sin embargo, su formación es mayormente independiente de la actividad del complejo de γ-tubulina y, en su lugar, depende de mecanismos conservados en metazoos, cruciales para la formación del huso acentrosómico, como la ruta del quinetocoro y el gradiente de RanGTP. Más allá, mejoramos su robustez estructural y fidelidad de segregación de cromosomas con la eliminación de la Quinesina-8, específicamente Klp6 pero no Klp5. Por último, estandarizamos nuestra metodología para la obtención, observación por videomicroscopía de fluorescencia y análisis del huso autoensamblado, lo cual permitió una caracterización más en detalle de su ensamblaje, dinámica de elongación y segregación de cromosomas.