Desarrollo de sistemas inteligentes para tratamientos contra el cáncer colorrectal

Abstract

[ES] El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los diferentes tipos de enfermedades que engloba el concepto de cáncer, ocupando el tercer lugar en incidencia a nivel mundial y es el segundo en mortalidad. La detección temprana es crucial para la supervivencia, y el tratamiento varía desde la cirugía en etapas tempranas hasta opciones más complejas en etapas avanzadas. A pesar de los avances, la investigación es esencial para reducir los efectos secundarios de los tratamientos y optimizar su selectividad, mejorando así la calidad de vida de los pacientes. La baja biodisponibilidad y falta de especificidad de los medicamentos antineoplásicos convencionales han llevado al interés creciente en el uso de nanomedicina en quimioterapia. Por ello, se han desarrollado sistemas de administración de fármacos que mejoran la biodistribución, actividad terapéutica y selectividad de los tratamientos. El objetivo central de esta tesis ha sido mejorar la eficacia de las terapias existentes y reducir los efectos secundarios, aprovechando las diferencias metabólicas entre células normales y cancerígenas. Con este fin, se llevaron a cabo tres estrategias. La primera estrategia desarrollada se enfocó en inhibir la proliferación celular al actuar simultáneamente sobre dos rutas metabólicas de las células cancerígenas. Para lo cual se utilizaron dos compuestos: pregnenolona (P5) y farnesol (FOH). P5 impide que las células tengan la energía necesaria para proliferar al inhibir la acción de la enzima G6PD en la ruta pentosa fosfato (PPP), mientras que, FOH impide la formación de membranas en las nuevas células inhibiendo la síntesis de fosfatidilcolina. Sin embargo, como ocurre con muchos de los fármacos anticancerígenos, estos compuestos tienen carácter hidrofóbico. Por lo que, se propuso el uso de ciclodextrinas (CD), oligosacáridos de alta solubilidad y estructura cónica hidrófoba, capaces de formar complejos de inclusión con moléculas huésped y mejorar las propiedades fisicoquímicas y farmacológicas de dichos compuestos. En primer lugar, se caracterizó la formación de los complejos de inclusión formados entre las moléculas de FOH y P5 con una ciclodextrina, SBE-β-CD. Las razones para usar esta CD es que tiene una elevada solubilidad acuosa y la ventaja de estar aprobada por la FDA. Los resultados de caracterización revelaron que la temperatura afectaba significativamente el proceso de complejación y que era instantáneo, obteniendo complejos con una estabilidad mínima de 2 meses. A continuación, se evaluó la toxicidad in vitro de P5 y FOH, tanto en su forma libre como en complejo (SBE-β-CD – P5 y SBE-β-CD – FOH), determinándose en cada caso, la concentración necesaria para inhibir un 50 % la proliferación celular (IC50). Dicho estudio evidenció que, en el caso de SBE-β-CD, las concentraciones superiores a 1 mM eran desfavorables para la viabilidad celular, señalando la necesidad de trabajar con niveles inferiores, para que la ciclodextrina no afecte a la proliferación celular. Respecto a la pregnenolona (P5), se presentaron ciertos problemas, como la necesidad de concentraciones elevadas de SBE-β-CD – P5 para alcanzar la IC50 o la precipitación de P5 cuando se utilizaba en su forma libre. Por estas razones se descartó la pregnenolona como posible tratamiento anticancerígeno y se suspendió su investigación. Por el contrario, los resultados obtenidos con el farnesol, tanto en su forma libre como en el complejo con SBE-β- CD, mostraron una IC50 prometedora, destacando mayor selectividad en la viabilidad de las líneas cancerígenas de colon, hígado y mama, en comparación con los fibroblastos normales. Los análisis del ciclo celular revelaron que el mecanismo de acción de FOH consistía en inhibir la síntesis de fosfatidilcolina (PC), este hecho se corroboró con ensayos de viabilidad celular. A su vez, la visualización microscópica destacó cambios morfológicos, como pérdida de adherencia y reducción celular, confirmando la eficacia del tratamiento. La investigación de esta estrategia finalizó con la validación in vitro de la eficacia terapéutica de SBE-β-CD – FOH, mediante ensayos con cocultivos. Los resultados demostraron su capacidad para reducir significativamente la viabilidad en líneas cancerígenas de colon e hígado, preservando la viabilidad en células normales. Además, se exploró la posibilidad de reducir costos al verificar que la toxicidad de farnesol no dependía significativamente del tipo de isómero utilizado. En conjunto, los resultados sugieren que los complejos de inclusión con FOH tienen un potencial terapéutico significativo en líneas cancerígenas. Sin embargo, con el propósito de dirigir de forma más específica los fármacos hacia las células cancerígenas, se llevó a cabo una segunda estrategia basada en encapsular los compuestos en exosomas. En primer lugar, se aislaron los exosomas utilizando diferentes métodos y se caracterizaron. Inicialmente se utilizó el producto comercial ExoQuick-TC® ULTRA para aislar exosomas, pero las muestras presentaban interferencias en la cuantificación y determinación de proteínas, lo que llevó a descartar este método. En contraste, el método de ultracentrifugación resultó efectivo, permitiendo el aislamiento de exosomas cuya forma esferoide se confirmó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Además, el análisis de Dispersión Dinámica de Luz (DLS) reveló que tenían diámetros inferiores a 200 nm. Y el ensayo de Western Blot (WB) confirmó la presencia de proteínas CD9 y HSP-70 confirmando que se trataba de exosomas. Posteriormente, los exosomas fueron cargados con los compuestos hidrófobos utilizando diversas técnicas. No obstante, debido al descarte de P5, se decidió trabajar con un compuesto ampliamente estudiado, Paclitaxel (PTX). La cuantificación de fármacos reveló que la extrusión era el método más eficaz, ya que se alcanzaban concentraciones de FOH y PTX más altas. Con estos exosomas se realizó una evaluación de la toxicidad in vitro y los resultados indicaron que los exosomas sin carga no afectaban significativamente a la viabilidad celular después de 48 horas, mientras que la viabilidad se redujo con los exosomas cargados con FOH y PTX. Los exosomas procedentes de la línea cancerígena cargados con FOH redujeron en mayor medida la viabilidad celular que los procedentes de la línea normal. Además, se produjo el mismo efecto con los cargados con PTX, aunque en este caso la reducción de la viabilidad fue mucho mayor. Al comparar estos resultados con los de SBE-β-CD – FOH, se observó que los exosomas redujeron la viabilidad de las células cancerosas de manera similar, pero afectando en menor medida a las células normales. Por lo que los exosomas, se presentan como una estrategia prometedora para el transporte selectivo en el tratamiento del cáncer colorrectal. Los resultados obtenidos sugieren que los exosomas pueden ofrecer ventajas significativas en términos de selectividad y eficacia en comparación con otras formas de administración de fármacos. Para finalizar esta tesis, se buscó mejorar el tratamiento local de CCR, llevándose a cabo una tercera estrategia que implica el desarrollo de una terapia local con hidrogeles termosensibles cargados con FOH. En una primera etapa, se determinó la composición óptima de hidrogeles compuestos por Pluronic F-127 (PF-127) y Goma Gellan (GG), a través de pruebas reológicas y evaluación de la degradación del gel. Se concluyó que la concentración óptima de PF-127 para obtener geles termosensibles estables era del 20 % w/v. Esta concentración permitió trabajar con soluciones líquidas a temperaturas inferiores a la ambiente y garantizó la formación de geles estables una vez alcanzada la temperatura de gelificación. La adición de GG al gel favoreció la formación de interacciones poliméricas, resultando en un aumento del módulo de almacenamiento, la viscosidad y la velocidad de degradación. GG demostró ser eficaz para controlar la sensibilidad a la temperatura, y una concentración del 0.50 % w/v duplicó la velocidad de degradación sin afectar significativamente la temperatura de gelificación. Posteriormente, se estudió el impacto de añadir FOH, tanto como fármaco libre o en forma de complejo de inclusión, en la reología y degradación del gel, utilizando geles con un 20 % de FP-127 y 0.5 % de GG. La principal conclusión fue que concentraciones elevadas de FOH libre afectaban negativamente la reología del gel debido a la formación de una emulsión. Por otro lado, la presencia de ciclodextrina (CD) producía una disminución del módulo de almacenamiento y la viscosidad, pero una prolongación del tiempo de degradación, esto se debe a que las cadenas hidrófobas de PF-127 formaban un complejo con la CD. Finalmente, se llevó a cabo un estudio de la cinética de liberación de FOH, permitiendo prever los parámetros que controlan la transferencia de materia tanto en el interior como en el exterior del hidrogel. Los estudios de liberación del fármaco indicaron que era sostenida y proporcional a la degradación del gel. Sin embargo, aunque la liberación de FOH libre resultó en concentraciones superiores a su solubilidad, se recomendaba el uso del complejo para lograr una solubilidad total del fármaco liberado con el fin de que pueda internalizar en las células. Estos resultados respaldan la posibilidad de emplear dicho hidrogeles como sistemas de liberación controlada para el tratamiento oncológico localizado. Además, se destaca el potencial de estos hidrogeles para ser utilizados en la simulación de tumores como se detalla en el Anexo I. Los resultados obtenidos de las tres estrategias presentaron avances significativos en la mejora del tratamiento del CCR. La estrategia de utilizar farnesol en forma de complejo con la ciclodextrina demostró eficacia terapéutica, los exosomas cargados con FOH y PTX exhibieron prometedores niveles de selectividad y los hidrogeles termosensibles ofrecen una terapia local controlada con liberación sostenida de FOH. Estos enfoques, basados en la nanotecnología y la terapia local, abren nuevas perspectivas para optimizar los tratamientos actuales contra el CCR. Todos estos estudios establecen una sólida base para futuras investigaciones, como el desarrollo de hidrogeles que permitan la liberación de exosomas cargados con farnesol y Paclitaxel, de tal forma que actúen únicamente contra células cancerígenas. Además, se podrían perfeccionar los hidrogeles, con el fin de que tengan una doble acción: liberación local de fármacos y regeneración del tejido dañado. [EN] Colorectal cancer (CRC) is one of the types of diseases that includes the concept of cancer, ranking third globally in incidence and second in mortality. Early detection is crucial for survival, the treatment varies from surgery in early stages to more complex options in advanced stages. Despite advances, research is essential to reduce the side effects of treatments and optimize their selectivity, thereby improving the quality of life for patients. The low bioavailability and lack of specificity of conventional antineoplastics have led to increasing interest in the use of nanomedicine in chemotherapy. For his reason, drug delivery systems (DDS) have been developed to enhance drug biodistribution, therapeutic activity, and treatment selectivity. The thesis aims has been to improve the effectiveness of current therapies and minimize side effects, taking advantage of the metabolic distinctions between normal and cancer cells. Three strategies were employed to achieve this goal. The first strategy focused on inhibiting cellular proliferation by simultaneously acting on different metabolic pathways of cancer cells. For this purpose, two compounds were used: pregnenolone (P5) and farnesol (FOH). P5 prevents cells from having the necessary energy to proliferate by inhibiting the action of the G6PD enzyme in the pentose phosphate pathway (PPP), while FOH prevents the formation of membranes in the new cells by inhibiting the synthesis of phosphatidylcholine. However, similar to many anticancer drugs, these compounds are hydrophobic. Therefore, the use of cyclodextrins (CD) was proposed. CD are oligosaccharides with high solubility and a hydrophobic conical structure, capable of forming inclusion complexes with guest molecules, thus improving their physicochemical and pharmacological properties. Firstly, the inclusion complex was characterized using SBE-β-CD and FOH/P5 molecules. SBE-β-CD was selected because it is an FDA-approved cyclodextrin and it has high aqueous solubility. Characterization results revealed that temperature significantly affected the complexation process, which was instantaneous, producing complexes with a minimum stability of 2 months. Next, the in vitro toxicity of P5 and FOH, both in their free form and in complex (SBE-β-CD – P5 and SBE-β-CD – FOH), was evaluated, determining the half-maximal inhibitory concentration (IC50) in each case. The study revealed that concentrations of SBE-β-CD above 1 mM affected adversely at cell viability, emphasizing the need to work with lower levels. Regarding pregnenolone (P5), certain issues arose, such as the need for elevated concentrations of SBE-β-CD – P5 to achieve IC50 or the precipitation of P5 when used in its free form. For these reasons, pregnenolone was ruled out as a potential anticancer treatment, and its investigation was suspended. In contrast, results with farnesol, both in its free form and in complex with SBE-β-CD, showed a promising IC50, highlighting greater selectivity in the viability of colon, liver, and breast cancer cell lines compared to normal fibroblasts. Cell cycle analysis revealed that the mechanism of action of FOH consisted of inhibiting the synthesis of phosphatidylcholine (PC), supported by cell viability assays. Microscopic visualization highlighted morphological changes, such as loss of adherence and cell reduction, confirming the effectiveness of the treatment. This strategy culminated with the in vitro validation of the therapeutic efficacy of SBE-β-CD – FOH, through co-culture assays. The results demonstrated its ability to significantly reduce viability in colon and liver cancer cell lines while preserving viability in normal cells. Furthermore, cost reduction possibilities were explored by confirming that farnesol toxicity did not significantly depend on the type of isomer used. Overall, the results suggest that inclusion complexes with FOH have significant therapeutic potential in cancer cell lines. However, with the aim of more specifically targeting drugs to cancer cells, a second strategy was implemented, involving encapsulating compounds in exosomes. Initially, exosomes were isolated using different methods and characterized. The initial attempt to use the commercial product ExoQuick-TC® ULTRA to isolate exosomes presented interferences in protein determination, leading to the dismissal of this method. In contrast, the ultracentrifugation method was effective, allowing the isolation of exosomes with a spheroid shape confirmed by transmission electron microscopy (TEM). Additionally, Dynamic Light Scattering (DLS) analysis revealed diameters below 200 nm. Western Blot (WB) assays confirmed the presence of CD9 and HSP-70 proteins, confirming their identity as exosomes. Subsequently, the exosomes were loaded with hydrophobic compounds using various techniques. However, due to the discarding of P5, it was decided to work with a widely studied compound, Paclitaxel (PTX). Drug quantification revealed that extrusion was the most effective method, achieving the highest concentrations. In vitro toxicity assessment with these exosomes indicated that unloaded exosomes did not significantly affect cell viability after 48 hours, while viability decreased with exosomes loaded with FOH and PTX. Exosomes from the cancer cell line loaded with FOH reduced cell viability to a greater extent than those from the normal cell line. Additionally, the same effect occurred with those loaded with PTX, although the reduction in viability was much greater. Comparing the results with SBE-β-CD – FOH, it was observed that exosomes reduced cancer cell viability similarly, with a lesser impact on normal cells. Therefore, exosomes emerge as a promising strategy for selective transport in colorectal cancer treatment. The results suggest that exosomes may offer significant advantages in terms of selectivity and efficacy compared to other drug administration forms. To conclude this thesis, a third strategy was implemented to improve local CRC treatment, involving the development of a local therapy with thermosensitive hydrogels loaded with FOH. In the first stage, the optimal composition of hydrogel, using Pluronic F-127 (PF-127) and Gellan Gum (GG),was determined through rheological tests and evaluation of gel degradation. The optimal concentration of PF-127 for obtaining stable thermosensitive gels was identified as 20%. This concentration allowed working with liquid solutions at temperatures below room temperature and ensured the formation of stable gels once the gelation temperature was reached. The addition of GG to the gel favoured the formation of polymeric interactions, resulting in an increase in storage modulus, viscosity, and degradation rate. GG proved effective in controlling temperature sensitivity, and a concentration of 0.50% doubled the degradation rate without significantly affecting the gelation temperature. Subsequently, the impact of adding farnesol on the rheology and degradation of the gel was studied. Using gels with 20% FP-127 and 0.5% GG, the impact of incorporating farnesol into the gel, both as a free drug and in the form of an inclusion complex, was studied. The main conclusion was that high concentrations of free FOH negatively affected the gel rheology due to the formation of an emulsion. On the other hand, the presence of cyclodextrin (CD) resulted in a decrease in storage modulus and viscosity but an extension of the degradation time because the hydrophobic chains of PF-127 formed a complex with CD. Finally, a study of the release kinetics of farnesol was conducted, allowing the anticipation of parameters controlling material transfer both inside and outside the hydrogel. Drug administration studies indicated sustained release proportional to gel degradation. However, although the release of free FOH resulted in concentrations exceeding its solubility, the use of the complex was recommended to achieve complete solubility of the released drug, allowing it to be internalized into cells. These results confirm the viability of hydrogels as controlled release systems for localized oncological treatment. Additionally, the potential of these hydrogels for simultaneous use in tissue regeneration is highlighted, as detailed in Anexo I. These findings establish a solid foundation for future research and clinical applications. The results obtained from the three strategies presented significant advances in improving CRC treatment. The strategy of using farnesol in complex form with cyclodextrin demonstrated therapeutic efficacy, loaded exosomes exhibited promising levels of selectivity, and thermosensitive hydrogels offer controlled local therapy with sustained release of farnesol. These approaches, based on nanotechnology and local therapy, present new perspectives for optimizing current CRC treatments. All these studies establish a solid foundation for future research, such as the development of hydrogels that allow the release of exosomes loaded with farnesol and Paclitaxel, acting only against cancer cells. Additionally, hydrogels could be refined to have a dual action: local drug release and regeneration of damaged tissue.