Modelado in vitro del Epitelio Pigmentario de la retina humana (hRPE) a partir de células de origen fetal, adulto y derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPS)

Abstract

[ES]El objetivo principal del presente trabajo es desarrollar y caracterizar un modelo in vitro de hRPE que reproduzca de manera fidedigna las propiedades fisiológicas del tejido in vivo, y cuya finalidad sea servir como plataforma de estudio de la fisiopatología de enfermedades oculares como la DMAE. Se espera que este modelo permita la comparación entre fenotipos normales y patológicos, así como la realización de modificaciones genéticas eficaces para estudiar la función de genes relacionados con esta patología. Con el fin de alcanzar este objetivo, en primer lugar, se evaluó la posibilidad de establecer un modelo in vitro utilizando células de hRPE adulto. Esta decisión estuvo motivada por la implementación de regulaciones más estrictas sobre el uso de células fetales en investigación, lo que condujo a descatalogar un modelo comercial a partir de células de origen fetal, que había sido ampliamente caracterizado y validado en nuestro laboratorio. Por tanto, se hizo necesario establecer un nuevo modelo experimental que ofreciera las mismas ventajas en términos de accesibilidad, rapidez, eficiencia y fidelidad con el hRPE in vivo. En el presente trabajo, en primer lugar, se ha llevado a cabo un análisis comparativo con el objetivo de evaluar la influencia de dos tipos de medios de cultivo, comercial de Lonza y retinal maturation media (RMM), sobre la madurez y polaridad celular de los modelos in vitro generados a partir de células de hRPE de origen adulto y fetal. En los grupos experimentales de células de origen fetal cultivadas con medio Lonza y adultas con medio RMM, se observó una densidad y un área celular similares a los encontrados en la mácula humana in vivo. Sin embargo, el análisis de marcadores de polaridad (uniones ocluyentes, complejos de polaridad, citoesqueleto y conductancia iónica) reveló que únicamente el modelo de origen fetal con Lonza presenta una distribución equiparable a la del RPE humano in vivo. En segundo lugar, en base a los resultados obtenidos y con el objetivo de optimizar el modelo de RPE de origen adulto, se evaluó el impacto de diferentes condiciones de cultivo, como el soporte, el material de la matriz y la densidad de sembrado. Si bien el soporte no afectó la viabilidad, se determinó que la matriz de recubrimiento a emplear debía adaptarse en función del origen celular. Además, se observó que el aumento de la densidad de sembrado mejoró la organización y polaridad celular es en el modelo obtenido a partir de células de origen fetal con RMM, pero no en las células de origen adulto. En tercer y último lugar, se generaron 3 nuevos modelos de hRPE a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) control y a partir de poblaciones heterogéneas con deleciones en los genes CRB2 y VEGFA. Se analizaron estas moléculas porque la proteína CRB2 es esencial para preservar la polaridad apicobasal del hRPE, una propiedad que se pierde durante los procesos patológicos de la DMAE y porque, por otra parte, el aumento de secreción de VEGFA contribuye al desarrollo de la DMAE exudativa. Los nuevos modelos de hRPE se compararon los de origen fetal y adulto. Los resultados revelaron que las células derivadas de iPS mostraron una mayor producción de melanina. De todos los grupos estudiados, solo las células de origen fetal, las derivadas de iPS control y las derivadas de un pool de iPS sin VEGFA forman monocapas sin alteraciones. Además, el análisis morfométrico reveló que las células de hRPE de origen fetal y adulto tienden a ser más alargadas que las derivadas de iPS. En cuanto a su polaridad, las células de origen fetal y derivadas de iPS manifestaron complejos de unión, complejos de polaridad, distribución del citoesqueleto, proteínas del ciclo visual y transportadores iónicos consecuentes con el hRPE in vivo. Sin embargo, los valores de TEER obtenidos en las células iPS indicaron una barrera epitelial menos efectiva.