Dorsal root ganglia transcriptomic analysis in experimental osteoarthritis identifies Ndfip2 as a regulator of TrkA signalling and nociception

Abstract

[ES]El dolor crónico es una enfermedad compleja e incapacitante con un impacto muy significativo a nivel personal, social y económico. En los países occidentales, una de las principales causas de dolor crónico es la osteoartritis (OA), una enfermedad degenerativa de las articulaciones. El factor de crecimiento nervioso (NGF) y su receptor, TrkA, son objetivos clave en el estudio de los mecanismos del dolor, ya que juegan un papel central en el desarrollo y plasticidad de los nociceptores. Aunque los anticuerpos bloqueantes de NGF son eficaces en la reducción del dolor osteoartrítico, también causan graves efectos secundarios. Por tanto, comprender los mecanismos mediante los cuales el eje NGF/TrkA contribuye al dolor osteoartrítico sigue siendo prioritario. La ubiquitinación es un mecanismo fundamental para la regulación del eje NGF/TrkA. TrkA es ubiquitinado tras su activación por NGF, lo que dirige su internalización, tráfico intracelular y degradación. Investigaciones previas en nuestro laboratorio han caracterizado la mutación P782S de TrkA, que impide la unión de la E3 ubiquitina ligasa Nedd4l al receptor. Esto redunda en la sobreactivación del eje NGF/TrkA, así como a una hipersensibilidad al dolor térmico e inflamatorio, especialmente frente a estímulos mecánicos en un modelo experimental de OA. La activación de TrkA provoca cambios en la expresión génica que contribuyen al dolor crónico de la OA. Sin embargo, los estudios transcriptómicos en los ganglios raquídeos son escasos, y esta investigación es la primera en centrarse en los cambios de expresión génica mediados por NGF/TrkA utilizando un modelo de ganancia de función de TrkA. Al inducir OA en la rodilla de ratones silvestres y mutantes TrkA P782S, exploramos los cambios transcriptómicos mediados específicamente por TrkA durante la progresión de la OA. Nuestro objetivo principal fue identificar genes y vías reguladas directamente por el eje NGF/TrkA en el contexto de la OA, que contribuyan a los mecanismos reguladores de la señalización NGF/TrkA en la nocicepción y el procesamiento del dolor. El análisis transcriptómico de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) L3-L5 ha revelado numerosos genes y rutas celulares previamente asociados con el dolor y la OA, los cuales ahora se confirman como regulados por el eje NGF/TrkA en este contexto; además, encontramos que genes diferencialmente expresados y rutas celulares previamente asociadas a la señalización NGF/TrkA se alteran durante la progresión de la OA. Estos incluyen reguladores transcripcionales como TP53 y los heterotrímeros SMAD2, 3 y 4, además de cascadas de señalización mediadas por receptores tirosina-kinasa y la familia MAPK. También destacamos nuevos posibles objetivos para la investigación del dolor en la OA, como Aak1, Kalrn y Kidins220, ampliamente estudiados en otros contextos de dolor, pero aun inexplorados en la OA. Entre estos genes diferencialmente expresados, identificamos también a Ndfip2, un adaptador y modulador de la familia Nedd4 de E3 ubiquitina ligasas, como un gen cuya expresión está controlada por el eje NGF/TrkA en condiciones de dolor. Hemos profundizado en sus funciones reguladoras del eje NGF/TrkA y en la nocicepción como segundo objetivo principal de este proyecto. Nuestros experimentos han confirmado su localización subcelular en el retículo endoplásmico y vesículas derivadas del complejo de Golgi en neuronas sensoriales. Hemos demostrado que Ndfip2 interacciona selectivamente con TrkA en neuronas de ganglios raquídeos, pero no con Nedd4l. Usando estrategias genéticas para modular la expresión de Ndfip2, hemos demostrado que regula los niveles de TrkA en su ruta biosintética, controlando su glicosilación, niveles en membrana y activación, pero no la ubiquitinación mediada por NGF. Este efecto es más pronunciado en ratones macho. En ratones knockout condicional de Ndfip2 en células que expresan TrkA hemos observado que Ndfip2 es crucial para la nocicepción mecánica y al frío, pero no afecta las respuestas al dolor térmico o inflamatorio. Además, Ndfip2 modula las diferencias sexuales en la respuesta a estímulos nociceptivos, aumentando el dimorfismo sexual en el dolor inducido por frío y formalina, pero disminuyéndolo en la nocicepción térmica y mecánica. Este fenotipo puede explicarse por el hecho de que Ndfip2 interactúa con y regula los canales iónicos TRPM8 y Piezo2, que son esenciales para la percepción del frío y mecánica, respectivamente. En conclusión, este estudio ha identificado varios genes y rutas involucrados en el dolor de la OA que son regulados por el eje NGF/TrkA. Entre ellos, Ndfip2 emerge como un modulador clave de los receptores de membrana relevantes para la nocicepción. En conjunto, estos hallazgos contribuyen a la comprensión de la regulación del eje NGF/TrkA, proporcionando valiosos conocimientos para futuras investigaciones en el campo del dolor

[EN]Chronic pain is a complex and debilitating condition with a significant personal, social and economic impact. In western countries, one of the major causes is osteoarthritis (OA), a degenerative joint disease. Nerve growth factor (NGF) and its receptor, TrkA, are key targets in the study of pain mechanisms, as they play a central role in the development and plasticity of nociceptors. Although NGF blocking antibodies have shown efficacy in reducing OA pain, they cause severe side effects. Therefore, understanding the mechanisms by which the NGF/TrkA axis contributes to osteoarthritic pain remains a critical research priority. Ubiquitination is a primary regulatory mechanism of the NGF/TrkA axis. TrkA undergoes ubiquitination upon NGF activation, which directs its internalisation, cellular trafficking and degradation. Previous research in our laboratory has characterised the P782S mutation of TrkA, which disrupts the binding of the E3 ubiquitin ligase Nedd4l to the receptor. This mutation leads to an overactivated NGF/TrkA axis and hypersensitivity to heat and inflammatory pain, and, in particular, to mechanical stimulation in an experimental model of osteoarthritis. TrkA activation leads to gene expression changes that contribute to chronic OA pain. However, transcriptomic studies in sensory ganglia are scarce and this research is the first to focus on F/TrkAmediated transcriptomic changes using a TrkA gain-of-function model. By inducing knee OA in wild-type and TrkA P782S mutant mice, we explored gene expression changes specifically mediated by TrkA during OA progression. Our primary goal was to identify genes and pathways that are directly regulated by the NGF/TrkA axis in the context of OA that contribute to the regulatory mechanisms of NGF/TrkA signalling in nociception and pain processing. Transcriptomic analysis of L3-L5 dorsal root ganglia (DRG) has revealed numerous genes and pathways previously associated with pain and OA which are now confirmed to be regulated by the NGF/TrkA axis in this context; moreover, DEGs and pathways previously associated with NGF/TrkA signalling that we have found to be altered in OA. These include transcriptional regulators such as TP53 and SMAD2, 3 and 4 heterotrimers, and signalling cascades mediated by receptor tyrosine kinases and the MAPK family. We also highlight new potential targets for OA pain research, such as Aak1, Kalrn and Kidins220, which are known in other pain contexts but remain unexplored in OA. Among these DEGs, we also identified Ndfip2, an adaptor and modulator of the Nedd4 family of E3 ubiquitin ligases, as a gene whose expression is controlled by the NGF/TrkA axis under pain conditions. We have performed further investigation due to its potential regulatory role as a second main goal of this project. Our experiments have confirmed its subcellular localisation in the endoplasmic reticulum and Golgi-derived vesicles also in sensory neurons. We have shown that Ndfip2 selectively interacts with TrkA in dorsal root ganglia neurons, but not with Nedd4l. Using genetic strategies to modulate Ndfip2 expression, we have shown that it regulates TrkA levels within its biosynthetic pathway, influencing receptor glycosylation, membrane levels and activation, rather than NGF-mediated ubiquitination. This effect is more pronounced in male mice. Conditional knockout of Ndfip2 in TrkA-expressing neurons in male and female mice has shown that Ndfip2 is critical for mechanical and cold nociception, but does not affect responses to heat or inflammatory pain. Furthermore, Ndfip2 modulates sex differences in response to nociceptive stimuli, increasing sexual dimorphism in cold and formalin-induced pain, but decreasing it in heat and mechanical nociception. This phenotype may be explained by our findings that Ndfip2 interacts with and regulates TRPM8 and Piezo2 ion channels, which are essential for cold and mechanical sensation respectively. In conclusion, our study has identified several genes and pathways involved in OA pain that are regulated by the NGF/TrkA axis. Among them, Ndfip2 emerges as a key modulator of membrane receptors relevant to nociception. Taken together, these findings pave the way for the understanding of NGF/TrkA signalling regulation, providing valuable insights that may contribute to future pain research.