Estudio del papel de Whi5 en la represión de la transcripción dependiente del complejo MBF en Schizosaccharomyces pombe

Abstract

[ES]Cuando las células de Schizosaccharomyces pombe se cultivan en medios ricos en nitrógeno, el ciclo celular se caracteriza por tener una fase G2 larga, durante la cual las células crecen hasta alcanzar el tamaño necesario para entrar en mitosis. Tras la división, las células poseen el tamaño umbral mínimo requerido para entrar en fase S, por lo que el punto de control G1/S es críptico en estas condiciones. En contraste, cuando las células se cultivan en medios pobres en nitrógeno, su ciclo celular se reprograma inmediatamente, la fase G2 se acorta y las células se dividen con un tamaño menor. Como consecuencia, las células extienden la fase G1 hasta alcanzar el tamaño necesario para que se produzca la duplicación del ADN, cobrando importancia el punto de control de tamaño G1/S. En ausencia total de nitrógeno, las células se dividen dos veces sin crecimiento y se bloquean en G1 para entrar en estado de quiescencia. La quiescencia es un estado reversible, conservado en eucariotas, que se caracteriza por una reducción del tamaño celular, un aumento de la resistencia a estrés, inducción de la autofagia, menor tasa de transcripción y traducción y aumento de longevidad. Tanto en condiciones de medios pobres en nitrógeno como en quiescencia, cuando las células extienden la fase G1 o se bloquean en esta fase, respectivamente, la maquinaria que promueve la transición G1/S ha de inactivarse. En S. pombe, la transición G1/S depende del complejo MBF, el ortólogo funcional de E2F y SBF/MBF en metazoos y Saccharomyces cerevisiae, respectivamente. La transcripción dependiente de E2F y SBF es inhibida por Rb en metazoos y Whi5 en S. cerevisiae, mediante el reclutamiento de los complejos histonas deacetilasas, HDAC1 o Rpd3, que deacetilan histonas de los promotores de sus genes diana. En S. pombe, el factor de transcripción que activa la expresión de los genes de fase S se denomina complejo MBF, ortólogo funcional de E2F en metazoos, y está compuesto por las subunidades Cdc10, Res1, Res2 y el co-activador Rep2. En meiosis, el complejo MBF se altera y se compone únicamente por Cdc10 y Res2, mientras que Rep1 se convierte en su co-activador. El complejo MBF está unido a los promotores de sus genes diana a lo largo del ciclo, y está regulado para restringir su actividad a la transición G1/S. Nrm1 y Yox1 actúan como represores al final de fase S y durante la fase G2. Sin embargo, se desconoce el mecanismo de represión del complejo MBF en situaciones en las que la fase G1 se extiende. Puesto que S. pombe posee una proteína, Whi5, que ha sido predicha como un represor de la transición G1/S, en esta Tesis Doctoral se ha propuesto estudiar la posible implicación de Whi5 en la inhibición de la transcripción dependiente del complejo MBF. Concretamente este trabajo se centra en: (1) estudiar el papel de Whi5 como represor del complejo MBF en células quiescentes, (2) estudiar el rol de Whi5 como represor de la transición G1/S en medios pobres en nitrógeno, (3) identificar las proteínas que interaccionan con Whi5 en células quiescentes y (4) estudiar el papel de las histonas deacetilasas en la represión de la expresión dependiente de MBF en quiescencia. Nuestros datos sugieren que Whi5 regula la transición G1/S en células cultivadas en medios pobres en nitrógeno. En estas condiciones, Whi5 se localiza en el núcleo y la sobreexpresión de whi5 mimetiza las deleciones de componentes del complejo MBF, como rep2 o res1, generando estrés replicativo y daño en el ADN, probablemente como consecuencia de una disminución de la actividad del complejo MBF. En contraste, la deleción de whi5 rescata los fenotipos de rep2∆ o res1∆, probablemente debido a un aumento de la actividad del complejo MBF. En células quiescentes, Whi5 se transloca al núcleo y reprime la expresión de genes dependientes del complejo MBF, concretamente, de genes de meiosis temprana. Acorde con este resultado, Whi5 interacciona específicamente con el complejo MBF formado por Cdc10 y Res2, aunque en quiescencia Res1 también forma parte del complejo. En último lugar, se determinó que Whi5 media el reclutamiento del complejo HDAC Clr6-I hacia los promotores de los genes dependientes del complejo MBF, promoviendo su desacetilación en un mecanismo conservado en S. cerevisiae y metazoo

[EN]When Schizosaccharomyces pombe cells are grown in nitrogen-rich medium, they divide with a large cell size after a long G2 phase. After division, cells possess the required size threshold to enter S phase. As a consequence, the G1/S checkpoint is cryptic under these conditions. In contrast, when cells are grown in nitrogen-poor media, the cell cycle is immediately reprogrammed, the G2 phase is shortened and cells divide with a smaller cell size. As a result, an extension of the G1 phase occurs, until cells reach the minimum size necessary for DNA duplication. In the total absence of nitrogen, cells divide twice without growth and undergo a cell cycle arrest in G1, before becoming quiescent cells. Quiescence is a cell cycle stage conserved in eukaryotes that is characterized by reversible cell cycle arrest in G1 phase, reduction in cell size, increased stress resistance, reduced transcription and translation, induction of autophagy and increased longevity. In nitrogen-poor media, when cells extend G1 phase, and in quiescence, when cells are blocked in G1 phase, the machinery that promotes the G1/S transition must be inactivated. In fission yeast, the transcription factor that activates the expression of S-phase genes is the MBF complex, the functional homologue of E2F in metazoans and MBF/SBF in S. cerevisiae. E2F and SBF-dependent transcription is inhibited by Rb in metazoans and Whi5 in S. cerevisiae, through recruitment of histone deacetylase complexes, HDAC1 or Rpd3, which deacetylate histones in the promoters of their target genes. In S. pombe the MBF complex consists of Cdc10, Res1, Res2 and Rep2 subunits. During meiosis, the MBF complex is disrupted and it consists of Cdc10, Res2, and Rep1 as a co-activator. The MBF complex is bound to its target genes promoters throughout the cell cycle and it is regulated to limit its activity during the G1/S transition. Nrm1 and Yox1 function as repressors at the end of S phase and during G2. Nevertheless, the repression mechanism of the MBF complex during G1 phase remains unclear. S. pombe possesses a protein, Whi5, predicted to act as a repressor of the G1/S transition. In this Doctoral Thesis we investigate the potential role of Whi5 in inhibiting MBF-dependent transcription. Specifically, this work focuses on: (1) examining the role of Whi5 as a repressor of the MBF complex in quiescent cells, (2) studying Whi5 function as a repressor of the G1/S transition under nitrogen-poor conditions, (3) identifying Whi5 interactors in quiescent cells, and (4) exploring the role of histone deacetylases in repressing MBF-dependent expression during quiescence. Our data suggest that Whi5 regulates the G1/S transition in cells cultured in nitrogen-poor media. Under these conditions, Whi5 localizes to the nucleus, and overexpression of whi5 mimics the deletions of MBF complex components, such as rep2 or res1, resulting in replicative stress and DNA damage, probably due to reduced MBF complex activity. In contrast, deletion of whi5 rescues the phenotypes associated with rep2∆ or res1∆, probably due to an increase in MBF activity. After induction of quiescence by nitrogen starvation, Whi5 protein is localized to the nucleus and represses the expression of MBF-dependent genes, specifically early meiosis genes. Consistent with this finding, Whi5 physically interacts with the MBF complex composed of Cdc10 and Res2, although Res1 is also part of the complex in quiescent cells. Finally, it was determined that Whi5 has a role in maintaining transcriptional repression of MBF-dependent genes in quiescence by the recruitment of the Clr6-I complex to gene promoters, promoting their deacetylation in a conserved mechanism in S. cerevisiae and metazoans