Functional study of the role of Rpb4 subunit phosphorylation in the regulation of gene transcription by RNA polymerase II

Abstract

[EN]Eukaryotic RNA polymerase II (RNAPII), the enzyme responsible for the synthesis of all messenger RNAs (mRNAs) and specific classes of non-coding RNAs (ncRNAs), consists of twelve subunits. Among them, Rpb4 and Rpb7 subunits form a heterodimeric (Rpb4/7) domain called “stalk”, which, at least in Saccharomyces cerevisiae, has a remarkable functional versatility. It is involved in several processes throughout the transcription cycle: it modulates RNAPII activity during transcription initiation and elongation, facilitates Rpb1-CTD dephosphorylation, is essential for gene loops formation and is required for the recruitment of termination/3'-end processing factors. In addition, Rpb4/7 has the ability to bind the mRNA (imprinting) and dissociate from the 10-subunit core upon transcription termination. Furthermore, Rpb4/7 transits to the cytoplasm, along with mRNAs, where it influences their translation and decay. However, the molecular mechanisms orchestrating these diverse nuclear and cytoplasmic functions remain poorly understood. In this study, we demonstrate that Rpb4 is a phosphoprotein, whose phosphorylation serves as a crucial regulatory mechanism coordinating transcription with post-transcriptional processes. We have identified five phospho-sites within Rpb4 protein sequence and showed that their modifications impair multiple aspects of gene expression. Inefficient Rpb4 phosphorylation leads to increased Rpb4 association with RNAPII, particularly at the genes 3'-ends, affects transcription elongation, polyadenylation site selection, and snoRNA termination. We identified the kinase Hrr25 and phosphatase Fcp1, known regulators of Rpb1-CTD phosphorylation levels, as key modulators of Rpb4 phosphorylation levels as well. Using RNA immunoprecipitation coupled with sequencing, we reveal that Rpb4 phosphorylation influences Rpb4/7 RNA-binding specificity and demonstrate altered association patterns with specific transcript populations. Proteomic analysis reveals altered interactions between Rpb4 and components of the translation machinery and, particularly, reduced association with ribosomal proteins and ribosome assembly factors. Moreover, widespread transcriptional changes affect approximately 30% of the yeast transcriptome, largely involved in translation-related processes and ribosome biogenesis. Altogether our findings point out to a role of Rpb4 phosphorylation as a molecular switch controlling its transition between nuclear and cytoplasmic functions through modulation of its interactions with RNAPII, RNA, and a variety of regulatory factors, thereby ensuring accurate coordination between transcription and post-transcriptional processes.

[ES]La ARN polimerasa II eucariótica (ARNPII), la enzima responsable de la síntesis de todos los ARN mensajeros (ARNm) y de algunas otros ARN no codificantes, está compuesta por doce subunidades. Entre ellas, las subunidades Rpb4 y Rpb7 forman un dominio heterodimérico (Rpb4/7) denominado "stalk" que, al menos en Saccharomyces cerevisiae, presenta una notable versatilidad funcional. Está implicado en diversos procesos a lo largo del ciclo de transcripción: modula la actividad de la ARNPII durante la iniciación y elongación de la transcripción, facilita la defosforilación del CTD de Rpb1, es esencial para la formación de bucles génicos y es necesario para el reclutamiento de factores de terminación y procesamiento del extremo 3'. Además, Rpb4/7 tiene la capacidad de unirse al ARNm (imprinting) y disociarse del núcleo de 10 subunidades tras la terminación de la transcripción. A su vez, Rpb4/7 se transloca al citoplasma junto con los ARNm, donde regula su traducción y degradación. Sin embargo, los mecanismos moleculares que coordinan esta variedad de funciones nucleares y citoplasmáticas no están completamente caracterizados. En este estudio, hemos demostrado que Rpb4 es una fosfoproteína cuya fosforilación actúa como un mecanismo regulador crucial que coordina la transcripción con los procesos postranscripcionales. Hemos identificado cinco sitios de fosforilación en la secuencia proteica de Rpb4 y demostrado que su fosforilación afecta a múltiples aspectos de la expresión génica. La fosforilación ineficiente de Rpb4 conduce a un aumento de la asociación de Rpb4 con la ARNPII, particularmente en los extremos 3' de los genes, afecta a la elongación de la transcripción, a la selección del sitio de poliadenilación y a la terminación de los ARN nucleolares pequeños (snoRNAs). Hemos identificado a la quinasa Hrr25 y a la fosfatasa Fcp1, conocidos reguladores de los niveles de fosforilación del CTD de Rpb1, como moduladores claves de la fosforilación de Rpb4. Mediante inmunoprecipitación de ARN acoplada a secuenciación, hemos descubierto que la fosforilación de Rpb4 influye en la especificidad de unión al ARN de Rpb4/7 y mostrando patrones de asociación alterados con poblaciones específicas de transcritos. El análisis proteómico ha revelado interacciones alteradas entre Rpb4 y componentes de la maquinaria de traducción y, particularmente, una reducción en la asociación con proteínas ribosomales y factores de ensamblaje del ribosoma. Además, se producen cambios transcripcionales generalizados que afectan aproximadamente al 30% del transcriptoma de levadura, principalmente implicados en procesos relacionados con la traducción y la ribogénesis. En conjunto, nuestros hallazgos señalan que la fosforilación de Rpb4 actúa como un interruptor molecular que controla su transición entre funciones nucleares y citoplasmáticas mediante la modulación de sus interacciones con la ARNPII, el ARN y diversos factores reguladores, asegurando así una coordinación precisa entre la transcripción y los procesos postranscripcionales.