Complejo mayor de histocompatibilidad clase ii porcino: polimorfismos e inmunopeptidomas propios y de patógnes de interés veterinario

Abstract

[ES] La especie porcina ha brindado grandes beneficios a la humanidad y, especialmente, la producción porcina dada la creciente demanda de carne de cerdo como fuente de proteína. Los sistemas de producción se enfrentan a diferentes retos y, entre ellos, están el manejo de las resistencias a los fármacos y el control de enfermedades infecciosas, algunas de gran impacto sanitario y económico. Enfermedades como la salmonelosis, colibacilosis y leptospirosis tienen un gran impacto en la salud animal y humana por su potencial zoonótico. El tratamiento de estas enfermedades con elevadas dosis de antibióticos ha favorecido el fenómeno de resistencia y aumentado, por tanto, el riesgo de morbilidad/mortalidad. Lo anterior hace necesario centrarse en la medicina preventiva, y especialmente, en las vacunas como alternativas a los antibióticos. Sin embargo, la identificación de antígenos bacterianos candidatos a vacunas que logren estimular una amplia respuesta inmunitaria adaptativa es otro gran reto. Por ello, las vacunas disponibles frente a estos patógenos se basan fundamentalmente en plataformas de bacterias vivas o atenuadas. En los últimos años, los avances con técnicas proteómicas como la espectrometría de masas han contribuido al desarrollo de la inmunopeptidómica, un método bio-analítico que permite la identificación de epítopos bacterianos presentados en el contexto de las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) y que pueden ser incluidos en novedosas plataformas vacunales basadas en péptidos. Los estudios inmunopeptidómicos pueden también mejorar enormemente nuestra comprensión de las vías de procesamiento y presentación de los antígenos. En la especie porcina no se han publicado estudios de inmunopeptidómica con moléculas CMH clase II. Las moléculas clase II del CMH se expresan en células profesionales presentadoras de antígenos como los macrófagos y las células dendríticas, entregando antígenos exógenos a los linfocitos T colaboradores CD4+, potenciando así la inmunidad adaptativa. En este trabajo se llevó a cabo la tipificación basada en secuenciación del gen porcino homólogo al CMH-II humano (SLA-DRB1) en porcinos de razas criollas colombianas e híbridos comerciales, comparando los resultados con datos reportados a nivel mundial. Se identificaron 21 alelos en seis poblaciones diferentes de Colombia. La diversidad del gen SLA-DRB1 en las poblaciones porcinas colombianas analizadas fue baja, con la mayor diversidad alélica en las poblaciones de Manta, Casco de Mula y San Pedreño. El alelo 02:01:01 se encontró en 5 poblaciones analizadas y se evidenció una menor diversidad alélica en los porcinos domésticos que en el jabalí. Por otra parte, se estimularon macrófagos obtenidos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de cerdos donantes homocigotos para el gen SLA-DRB1 con los patógenos Salmonella typhimurium, Escherichia coli y Leptospira pomona de forma independiente, durante un período de 20 horas. Las células infectadas se lisaron y los inmunocomplejos fueron capturados utilizando una columna de afinidad basada en el anticuerpo L243 unido a proteína A. Los péptidos eluidos fueron analizados por espectrometría de masas con el fin de identificar el mayor número de péptidos bacterianos posibles y con el fin de garantizar la calidad de las identificaciones utilizadas para el entrenamiento de la red neural ajustada. La mayoría de los péptidos identificados resultaron del procesamiento interno (97,89 %) mientras que los péptidos de origen bacteriano representaron un porcentaje menor (2,11%). De particular interés vacunal son los péptidos bacterianos identificados: 31 péptidos de Salmonella typhimurium, 3 de Leptospira pomona y 84 de E. coli. Se identificaron varios péptidos de la proteína de membrana externa-A y de la proteína chaperonina GroEL, que podrían ser considerados candidatos vacunales promisorios. Finalmente, se utilizaron los péptidos identificados por espectrometría de masas para el entrenamiento de los predictores. Se trabajó con el servidor GibbsCluster que identifica motivos de unión al CMH-Clase II, NetMHCIIpan-4.0 para predecir la capacidad de elución de las moléculas analizadas ajustado con los alelos del estudio y con el predictor MixMHC2pred para estudiar la afinidad de unión con el SLA. Se observó que la mayoría de los péptidos aislados en el proceso de inmunopurificación fueron predichos por la red neural ajustada NetMHCIIpan-4.0. Sin embargo, encontramos diferencias en las predicciones de los motivos de elución para cada uno de los haplotipos analizados. Como conclusión, el enfoque de inmunopeptidómica aplicado en este estudio fue una estrategia útil con la cual se logró la caracterización de los perfiles de elución de las moléculas clase II de tres individuos homocigotos. Los métodos aplicados y los resultados obtenidos pueden sentar las bases para i) el desarrollo de herramientas eficaces de predicción de epítopos inmunogénicos y ii) la selección de candidatos a vacunas a integrar en plataformas vacunales basadas en multi-epítopos, soluciones de gran interés para la prevención y manejo de enfermedades infecciosas en animales de producción.