TOR regulates silencing of Tf2 retrotransposons through tRNA modifications during entry into quiescence in Shizosaccharomyces pombe

Abstract

[EN] In Schizosaccharomyces pombe, quiescence is triggered by nitrogen starvation. Under these conditions, proliferating cells undergo two consecutive divisions without growth and arrest in G1 phase, ultimately entering a quiescent G0 state. The conserved Greatwall-Endosulfine-PP2A/B55 (GEP) pathway acts as a key molecular sensor, transducing the nitrogen starvation signal to the cell cycle machinery and accelerating the final divisions required for quiescence entry. Upon TORC1 inactivation, the Greatwall-Endosulfine switch becomes active, leading to the inhibition of the PP2A/B55 phosphatase. This facilitates phosphorylation of Cdk1/Cyclin B targets for mitotic entry and activation of TORC2 targets, such as the AKT orthologue Gad8, promoting mitosis, quiescence, differentiation and mating. Nitrogen starvation also triggers a switch between TORC1 and TORC2 activity. Elongatordependent tRNA modifications are essential for this nutrient-driven switch by promoting the efficient translation of AAA codon-enriched mRNAs, including those encoding TORC2 activators (tor1, ste20, gad8) and TORC1 inhibitors (tsc1, tsc2, npr2, npr3). Simultaneously, TORC2 enhances Elongator activity by inhibiting Gsk3 through Gad8-mediated phosphorylation of Elp4 at serine 114. This establishes a positive feedback loop between TORC2 and Elongator, reinforcing the TORC1-to- TORC2 transition. Recently it has been demonstrated that the GEP pathway regulates the switch from TORC1 to TORC2 during entry into quiescence by enhancing Elongator-dependent tRNA modifications at the anticodon stem-loop, increasing the translation efficiency and fidelity of mRNAs enriched for AAA versus AAG lysine codons. Under nitrogen starvation, activation of the GEP pathway allows proper inhibition of PP2A/B55, which is critical for the accumulation of phosphorylated Gad8 and full activation of TORC2. TORC2 then promotes the activity of Elongator, establishing the positive feedback loop between TORC2 and Elongator. In cells lacking Endosulfine, this regulatory cascade is disrupted: PP2A/B55 remains active, Gad8 phosphorylation is reduced, and Elongator function is impaired. Consequently, levels of critical tRNA modifications decline, leading to inefficient translation of specific transcripts involved in TOR signalling and nuclear architecture. These modifications enhance translation of mRNAs essential for telomere-anchoring at the nuclear envelope and subtelomeric gene silencing. In addition to subtelomeric derepression, Greatwall and Endosulfine mutants display upregulation of Tf2 retrotransposon genes during nitrogen starvation. Transposable elements constitute a significant portion of eukaryotic genomes, with retrotransposons representing a major subclass capable of transcribing and integrating into the host genome. The insertion of retrotransposon-derived cDNA is inherently mutagenic and poses a threat to genome integrity. As a result, retrotransposon activity must be tightly controlled throughout the organism's life cycle to preserve genomic stability. In this doctoral thesis, the role of the Greatwall-Endosulfine-PP2A/B55 pathway in the silencing Tf2 retrotransposons during entry into quiescence in Schizosaccharomyces pombe has been investigated. Specifically, this work: (1) analyses the effect of Endosulfine loss on Tf2 expression, particle formation, and mobilization under nitrogen starvation; (2) determines how lysine AAA codon bias influences the translation of proteins involved in Tf2 regulation; and (3) assesses whether the absence of Endosulfine results in increased Tf2 insertions and to evaluate the potential adaptive or deleterious consequences of these events during quiescence. The results obtained in this thesis suggest that the Greatwall-Endosulfine-PP2A/B55 signalling pathway acts as a key regulator of Tf2 retrotransposons during entry into quiescence in S. pombe, by coordinating codon-biased translation of essential repressors involved in transcriptional silencing, nuclear organization, and autophagic degradation. In the absence of Endosulfine, sustained PP2A activity disrupts TORC2-Gad8 signalling and impairs tRNA modifications, leading to reduced translation of proteins highly enriched in AAA lysine codons. Among these are Tf2 repressors (Cbp1/Abp1, Set1C subunits, HDACs), the nuclear envelope protein Lem2, and autophagy-related factors Atg2 and Atg4. This dysfunction results in increased Tf2 expression, elevated histone acetylation at Tf2 loci, accumulation of viral-like particles, and increased retrotransposon mobilization. Mobilized Tf2 elements preferentially reintegrate into existing Tf2 loci or intergenic or ncRNA-rich regions, suggesting a potential role in transcriptional stress response. However, when silencing, nuclear organization, and degradation mechanisms fail, Tf2 activation may become deleterious, promoting genomic instability and compromising cell survival during quiescence. These findings highlight the importance of post-transcriptional regulation and codonspecific regulated translation in the control of transposable elements during stress adaptation.

[ES] En Schizosaccharomyces pombe, la entrada en quiescencia se produce en respuesta a privación de nitrógeno. En estas condiciones, las células proliferativas completan dos divisiones consecutivas sin crecimiento y se detienen en la fase G1, entrando finalmente en un estado quiescente G0. La ruta conservada Greatwall-Endosulfina-PP2A/B55 (GEP) actúa como un sensor molecular clave que transmite la señal de ausencia de nitrógeno a la maquinaria del ciclo celular, acelerando las divisiones finales necesarias para la entrada en quiescencia. Tras la inactivación de TORC1, el interruptor Greatwall-Endosulfina se activa, lo que lleva a la inhibición de la fosfatasa PP2A/B55. Esta inhibición facilita la fosforilación de los sustratos de Cdk1/Ciclina B para la entrada en mitosis, así como la activación de los sustratos de TORC2, como el ortólogo de AKT Gad8, promoviendo la entrada en mitosis, en quiescencia y la diferenciación sexual. La ausencia de nitrógeno también desencadena una transición entre las actividades de TORC1 y TORC2. Las modificaciones de ARNt dependientes de Elongator son esenciales para esta transición en respuesta a las condiciones nutricionales, ya que promueven la traducción eficiente de ARNm enriquecidos en codones AAA, incluidos aquellos que codifican activadores de TORC2 (tor1, ste20, gad8) e inhibidores de TORC1 (tsc1, tsc2, npr2, npr3). Simultáneamente, TORC2 activa a Elongator mediante la inhibición de Gsk3, a través de la fosforilación de Elp4 en la serina 114 mediada por Gad8. Esto establece un bucle de retroalimentación positiva entre TORC2 y Elongator, reforzando la transición de TORC1 a TORC2. Recientemente se ha demostrado que la ruta GEP regula esta transición durante la entrada en quiescencia al activar las modificaciones de ARNt dependientes de Elongator en el bucle del anticodón, aumentando la eficiencia y fidelidad en la traducción de ARNm enriquecidos en codones AAA para la lisina frente a AAG. En ausencia de nitrógeno, la activación de la ruta GEP permite una inhibición adecuada de PP2A/B55, lo que resulta fundamental para la acumulación de Gad8 fosforilado y la activación completa de TORC2. TORC2 promueve entonces la actividad de Elongator, estableciendo el bucle de retroalimentación positiva entre ambos. En células carentes de Endosulfina, esta cascada reguladora se ve interrumpida: PP2A/B55 permanece activa, la fosforilación de Gad8 se reduce y la función de Elongator se ve comprometida. En consecuencia, disminuyen los niveles de modificaciones críticas de los ARNt, lo que conlleva una traducción ineficiente de transcritos específicos implicados en la señalización TOR y en la arquitectura nuclear. Estas modificaciones son clave para la traducción de ARNm esenciales en el anclaje telomérico a la envuelta nuclear y en la represión de los genes subteloméricos. Además de la desrepresión subtelomérica, los mutantes de Greatwall y Endosulfina presentan una sobreexpresión de genes de los retrotransposones Tf2 durante la privación de nitrógeno. Los elementos transponibles constituyen una parte significativa de los genomas eucariotas, siendo los retrotransposones una subclase importante con capacidad para transcribirse e integrarse en el genoma del hospedador. La inserción de ADNc derivado de retrotransposones es intrínsecamente mutagénica y representa una amenaza para la integridad genómica. Por tanto, la actividad de los retrotransposones debe estar estrictamente regulada a lo largo del ciclo de vida del organismo para preservar la estabilidad del genoma. En esta tesis doctoral se ha investigado el papel de la ruta Greatwall-Endosulfina-PP2A/B55 en la represión de los retrotransposones Tf2 durante la entrada en quiescencia en Schizosaccharomyces pombe. Concretamente, este trabajo se centra en: (1) analizar el efecto de la pérdida de Endosulfina sobre la expresión, formación de partículas y movilización de los Tf2 bajo condiciones de ausencia de nitrógeno; (2) determinar cómo el sesgo hacia los codones AAA para la lisina influye en la traducción de proteínas implicadas en la regulación de los Tf2; y (3) evaluar si la ausencia de Endosulfina conduce a un aumento de las inserciones de los Tf2 y examinar sus posibles consecuencias adaptativas o perjudiciales durante la quiescencia. Los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la ruta de señalización Greatwall- Endosulfina-PP2A/B55 actúa como un regulador clave de los retrotransposones Tf2 durante la entrada en quiescencia en S. pombe, al coordinar la traducción de represores de los Tf2, implicados en la represión transcripcional, la organización nuclear y la degradación autofágica, con alto contenido en el codón AAA para la lisina. En ausencia de Endosulfina, la actividad sostenida de PP2A reduce la señalización TORC2-Gad8 y deteriora las modificaciones de tRNA, lo que provoca una disminución en la traducción de proteínas altamente enriquecidas en codones AAA para la lisina. Entre ellas se encuentran represores de los Tf2 (Cbp1/Abp1, subunidades de Set1C, HDACs), la proteína de la envuelta nuclear Lem2 y proteínas de autofagia como Atg2 y Atg4. Esta disfunción provoca un aumento en la expresión de Tf2, una mayor acetilación de histonas en sus locus, acumulación de partículas tipo viral y una mayor movilización de los Tf2. Los elementos Tf2 movilizados tienden a reintegrarse en los locus de Tf2 preexistentes o en regiones intergénicas o en regiones ricas en ARN no codificantes, lo que sugiere un posible papel en la respuesta transcripcional al estrés. Sin embargo, cuando fallan los mecanismos de represión, organización nuclear y degradación, la activación de los Tf2 puede volverse perjudicial, promoviendo la inestabilidad genómica y comprometiendo la supervivencia celular durante la quiescencia. Estos resultados resaltan la importancia de la regulación post-transcripcional y de la traducción regulada de manera codón-específica en la represión de los retrotransposones Tf2 bajo condiciones de estrés.