Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

[ES] PCNA (Antígeno nuclear de células en proliferación) es una proteína esencial, altamente conservada a lo largo de la evolución, desde bacterias hasta mamíferos. Esta molécula, que actúa abrazando al ADN, orquesta numerosos procesos relacionados con la replicación y reparación del genoma. PCNA sirve como plataforma sobre la que se unen distintas proteínas para realizar sus funciones sobre el ADN, como por ejemplo las ADN polimerasas Pol ε y Pol δ. Uno de los mecanismos moleculares que permite a PCNA dirigir qué proteínas o rutas señalizadoras deben actuar es su modificación postraduccional (PTM). Particularmente relevante para este trabajo es la modificación de PCNA mediante la adición de subunidades de ubiquitina. Tradicionalmente, esta PTM ocurre cuando las polimerasas Pol ε y Pol δ se bloquean porque su centro catalítico no se puede adaptar a una lesión en el ADN. Para evitar el colapso del proceso replicativo, PCNA se ubiquitina, activando así las denominadas rutas de tolerancia al daño en el ADN (DDT, del inglés DNA Damage Tolerance). Estas vías permiten atravesar las lesiones y continuar la replicación. Sin embargo, dado que estas rutas conllevan ciertos riesgos para la integridad genómica, deben estar estrictamente reguladas. La forma de desactivarlas es mediante la eliminación de las marcas de ubiquitina en PCNA por acción de desubiquitinasas. En Saccharomyces cerevisiae, el organismo modelo de este estudio, antes de comenzar este trabajo se conocían dos desubiquitinasas de PCNA (PCNA-DUBs): Ubp10 y Ubp12. Estas proteasas colaboran regulando las rutas DDT de forma asimétrica en las dos hebras del ADN, las cuales, además, se replican mediante mecanismos distintos. La hebra líder se replica de manera continua, mientras que la hebra rezagada lo hace de forma discontinua, mediante la síntesis de millones de fragmentos cortos conocidos como Fragmentos de Okazaki, que posteriormente se procesan y unen para formar una hebra continua en un proceso denominado maduración de fragmentos de Okazaki (OFM). En este trabajo partimos de la identificación de una nueva PCNA-DUB, Ubp1. Aunque esta proteína se había descrito exclusivamente como citoplasmática, aquí identificamos una subpoblación nuclear que participa en la desubiquitinación de PCNA. Colaborando con las ya conocidas Ubp10 y Ubp12, Ubp1 contribuye a evitar la acumulación de PCNA ubiquitinado durante la replicación del ADN. La eliminación combinada de estas tres proteínas provoca la acumulación crónica de PCNA ubiquitinado incluso en condiciones no perturbadas, es decir, en ausencia de daño exógeno al ADN. En este contexto, establecemos una relación causa-efecto entre dicha acumulación crónica y un proceso replicativo lento e ineficiente. Además, demostramos que, bajo condiciones de estrés replicativo, cuanto mayor es el defecto en la desubiquitinación de PCNA debido a la ausencia de las PCNA-DUBs, mayor es la acumulación de estructuras replicativas asociadas a las rutas de tolerancia al daño, determinando una correlación directa entre ambos fenómenos.Por otro lado, este trabajo también explora el posible papel de la desubiquitinación de PCNA en la replicación de la hebra rezagada, concretamente durante la maduración de los fragmentos de Okazaki (OFM). En este contexto, demostramos que Ubp10 participa directamente en dicho proceso a través de su actividad desubiquitinadora sobre PCNA. La ausencia de Ubp10 provoca un defecto en este proceso, lo que conduce a una acumulación patológica de PCNA en la cromatina. Esta retención anómala constituye la causa última de una maduración incorrecta de los fragmentos de Okazaki, impidiendo que sean ligados en el tiempo adecuado. Determinamos que estos defectos derivados de la pérdida de Ubp10 son completamente suprimidos mediante el uso de alelos inestables de PCNA, que favorecen su descarga espontánea de la cromatina. Finalmente, concluimos que esta OFM defectiva, consecuencia directa de la falta de Ubp10, en última instancia provoca un defecto replicativo a lo largo de todo el genoma, que se manifiesta como una duplicación del ADN lenta e ineficiente.

[EN] PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) is an essential protein highly conserved throughout evolution, from bacteria to mammals. PCNA acts as a sliding clamp that encircles DNA, coordinating numerous processes involved in DNA replication and repair. It functions as a platform that recruits and organizes numerous protein partners, such as DNA polymerases Pol ε and Pol δ, to carry out their functions on the genome. One of the key molecular mechanisms through which PCNA directs protein recruitment and pathway choice is its post-translational modification (PTM). Particularly relevant to this work is the ubiquitylation of PCNA, which typically occurs when DNA polymerases are stalled due to DNA lesions that block their catalytic activity. In response, PCNA becomes ubiquitylated, triggering the DNA damage tolerance (DDT) pathways, allowing replication to bypass DNA lesions. However, because these pathways carry inherent risks for genomic instability, they must be tightly regulated. Their timely inactivation depends on the removal of ubiquitin moieties from PCNA by specific deubiquitylating enzymes. In Saccharomyces cerevisiae, the model organism used in this study, two PCNA-specific deubiquitylases (PCNA-DUBs) have been characterized to date: Ubp10 and Ubp12. These two PCNA-DUBs regulate DDT asymmetrically on the two DNA strands, which are replicated through distinct mechanisms. While the leading strand is synthesized continuously, the lagging strand is replicated discontinuously through the synthesis of millions of short DNA segments known as Okazaki fragments. These are later processed and ligated into a continuous strand during the Okazaki Fragment Maturation (OFM) process. In this work, we identify and characterize a novel PCNA-DUB, Ubp1. Previously reported as an exclusively cytoplasmic protein, we now demonstrate the existence of a nuclear subpopulation of Ubp1 that participates in PCNA deubiquitylation. Collaborating with Ubp10 and Ubp12, Ubp1 contributes to the prevention of PCNA ubiquitylation accumulation during DNA replication. Combined deletion of these three PCNA-DUBs leads to chronic accumulation of PCNA-K164 ubiquitylation even under unperturbed conditions, in the absence of exogenous DNA damage. We establish a direct causal link between this persistent ubiquitylation and delayed defective DNA replication. Moreover, we demonstrate that under replication stress, the greater the defect in PCNA deubiquitylation due to the absence of PCNA-DUBs, the higher the accumulation of replication intermediates associated with DNA damage tolerance pathways, revealing a direct correlation between them. Furthermore, this study also explores a role for PCNA deubiquitylation in lagging-strand replication, specifically during OFM. We show that Ubp10 directly participates in this process through its PCNA deubiquitylation activity. Loss of Ubp10 results in defective deubiquitylation, leading to pathological retention of PCNA on chromatin. This unscheduled retention disrupts timely OFM, preventing proper ligation of Okazaki fragments. We demonstrate that defects arising from Ubp10 loss are fully suppressed by disassembly-prone PCNA mutants, which promote spontaneous PCNA unloading from chromatin. Ultimately, we conclude that defective OFM due to Ubp10 depletion leads to a genome-wide replication defect, manifested as slow and inefficient DNA synthesis.