Ultrashot Pulse Laser-Induced Photodynamics and Microprocessing of Elastomers for Biomedical Engineering

Abstract

[ES] Esta tesis se centra principalmente en la generación, detección, caracterización y aplicación eficientes de pulsos láser ultracortos en el procesamiento de diversos materiales para aplicaciones biológicas y médicas. Para ello, se empleó un oscilador láser de Ti:Zafiro amplificado mediante un sistema de amplificación de pulsos, logrando duraciones de pulso cortas en el rango de femtosegundos, con una frecuencia de repetición de 5 kHz y una energía de hasta 1,6 mJ por pulso. Estos pulsos se sintonizan espectralmente mediante un amplificador paramétrico. La longitud de onda del pulso se modula mediante procesos no lineales, lo que permite sintonizarlo en un rango de 240 a 2400 nm. Este mecanismo permite que el láser de Ti:Zafiro sirva como fuente de pulsos ópticos ultracortos. Instrumentos como FROG o SPIDER se utilizan habitualmente para identificar pulsos ultracortos. Estos pulsos se caracterizan por su duración extremadamente corta, lo que permite la monitorización de procesos físicos, químicos y biológicos ultrarrápidos. Además, presentan un amplio ancho de banda espectral, alta intensidad y energía de pico debido a su concentración en un período de tiempo reducido. Se han caracterizado y optimizado numerosos parámetros experimentales, como el tamaño y la potencia del haz láser, la geometría de enfoque, el tiempo de tratamiento, las fibras ópticas utilizadas, entre otros, para lograr los objetivos deseados.

Recientemente, las técnicas ópticas se han aplicado ampliamente en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento médicos. Diversas técnicas de imagen óptica y espectroscopía han alcanzado un éxito significativo en la investigación médica y biológica. La fluorescencia con resolución temporal es una de estas técnicas y constituye una herramienta poderosa para el estudio de tejidos y células. El primer capítulo de esta tesis describe la fluorescencia con resolución temporal de dos muestras diferentes, BODIPY y DEXTRAN-TR, tras la excitación con un haz láser ultrarrápido. Optimizamos la configuración experimental para las mediciones de fluorescencia de los fluoróforos BODIPY y DEXTRAN-TR y diseñamos un programa MATLAB que permite la reconstrucción de la función de fluorescencia real. Este enfoque busca que esta técnica sea compatible con diversas aplicaciones biomédicas. Este trabajo tiene como objetivo investigar, desarrollar y validar la aplicación de la fluorescencia con resolución temporal en vasos sanguíneos, diagnóstico de tejidos médicos y cirugía oncológica. La configuración experimental se optimizó para maximizar la fluorescencia y determinar la resolución espectral. La fibra óptica fue uno de los componentes más importantes responsables de esto. El núcleo de la fibra actúa como una rendija de entrada y, por lo tanto, su tamaño afecta la precisión del dispositivo. Cuanto más estrecha y pequeña sea la abertura del núcleo, menor será la cantidad de fluorescencia capturada y mayor la resolución espectral. Por el contrario, cuanto más grande sea el núcleo de la fibra, mayor será la cantidad de luz capturada, que es el resultado deseado, obteniendo una señal de fluorescencia de mayor intensidad y logrando una mejor relación señal-detector. Para este propósito, se utilizaron fibras con un tamaño de rendija de 10 micrómetros y una resolución de entre 0,4 y 0,8 nanómetros. También se presentaron métodos de análisis, filtrado y procesamiento de datos para eliminar el ruido significativo y mostrar los tiempos de vida de la fluorescencia de las dos muestras. Las aplicaciones más importantes de esta tecnología se demostraron en la terapia fotodinámica basada en BODIPY, las sondas BODIPY para membranas lipídicas y los sensores de pH fluorescentes basados en BODIPY para membranas lipídicas. También se destacó la importancia del colorante DEXTRAN-TR en la adhesión celular, la diferenciación y el mantenimiento tisular, y el reconocimiento y la clasificación celular, además de medir la permeabilidad vascular y evaluar el equilibrio iónico. Esta técnica revela las propiedades únicas de los fluoróforos estudiados midiendo la intensidad de fluorescencia en función de la longitud de onda de la luz, midiendo así la fluorescencia transitoria resuelta en el tiempo a longitudes de onda específicas, caracterizando posteriormente estos fluoróforos y extrayendo sus propiedades más importantes.

El segundo capítulo de esta tesis presenta un método flexible, preciso y reproducible para la fabricación de membranas porosas de PDMS mediante ablación láser de pulsos ultracortos, propuesto como una alternativa a las técnicas convencionales. Se microtaladraron de forma sistemática membranas de PDMS con espesores de 25, 50 y 100 microm para investigar la influencia de los principales parámetros del láser - energía por pulso y tiempo de apertura del obturador - sobre las dimensiones, geometría y calidad de los orificios consecuentes. Los resultados indican que la energía del pulso es el factor dominante que afecta a las dimensiones de los agujeros, mientras que los tiempos de apertura por encima de 1000 ms y el espesor de la membrana cuentan con un rol secundario. Se ha apreciado como una mayor energía total aportada incrementa el ángulo de conicidad de los orificios, y que la extensión de la zona afectada térmicamente está directamente relacionada con el diámetro del haz láser y el espesor de la membrana. Se desarrolló un modelo numérico para simular el proceso de ablación, incorporando el efecto de apantallamiento por plasma, y mostrando que la eliminación de material depende fuertemente de la energía del pulso. A partir de los datos experimentales, se formuló un modelo empírico para estimar la energía por pulso óptima para fabricar membranas con orificios de 10 microm de diámetro y una separacion de 40 microm. Las predicciones del modelo mostraron buena concordancia con las mediciones experimentales en cuanto al diámetro de salida de los orificios, mientras que se observaron mayores desviaciones en el diámetro de entrada. Finalmente, para validar la viabilidad biológica de las membranas producidas, se cultivaron células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano sobre las láminas de PDMS procesadas con láser y se integraron en dispositivos órgano-en-chip (Organ-on-chip, OoC). Las células mostraron una fuerte adhesión y una alta actividad metabólica, lo que confirma la idoneidad de este método de fabricación basado en láser para la manufactura de membranas de PDMS en sistemas OoC.

[EN] This thesis focuses primarily on the efficient generation, detection, characterization, and application of ultrashort laser pulses in the processing of various materials for biological and medical applications. For this purpose, a Ti:Sapphire laser oscillator amplified using a pulse amplification system was used, achieving short pulse durations in the femtosecond range with a repetition rate of 5 kHz and energy up to 1.6 mJ per pulse. These pulses are spectrally tuned using a parametric amplifier. The pulse wavelength is modulated through nonlinear processes, allowing it to be tuned within a range of 240 to 2400 nm. This mechanism enables the Ti:Sapphire laser to serve as a source of ultrashort optical pulses. Instruments such as FROG or SPIDER are typically used to characterize ultrashort pulses. These pulses are characterized by their extremely short duration, which allows for the monitoring of ultrafast physical, chemical, and biological processes. They also have a wide spectral bandwidth, high intensity, and high peak energy due to the energy being concentrated within a narrow time period. Many experimental parameters such as laser beam size and power, focusing geometry, treatment time, optical fibers used, and others have been characterized and optimized to achieve the desired goals.

Recently, optical techniques have been widely applied in medical diagnosis, prognosis, and treatment. Several optical imaging and spectroscopy techniques have achieved significant success in medical and biological research. Time-resolved fluorescence is one of these techniques, and it is a powerful tool for studying tissues and cells. The first chapter of this thesis describes time-resolved fluorescence of two different samples, BODIPY and DEXTRAN-TR, after excitation with an ultrafast laser beam. We optimized the experimental setup for fluorescence measurements of both BODIPY and DEXTRAN-TR fluorophores and designed a MATLAB program that allows reconstruction of the real fluorescence function. This approach aims to make this technique compatible with various biomedical applications. This work aims to research, develop, and validate the application of time-resolved fluorescence within blood vessels, medical tissue diagnosis, and cancer surgery. The experimental setup was optimized to maximize fluorescence and determine the spectral resolution. The optical fiber was one of the most important components responsible for this. The fiber core acts as an input slit, and therefore its size affects the accuracy of the device. The narrower and smaller the opening of the core, the smaller the amount of fluorescence captured and the greater the spectral resolution. Conversely, the larger the fiber core, the greater the amount of light captured, which is the desired result, obtaining a higher-intensity fluorescence signal and achieving a better signal-to-detector ratio. For this purpose, fibers with a slit size of 10 micrometers and a resolution ranging from 0.4 to 0.8 nanometers were used. Data analysis, filtering, and processing methods were also presented to eliminate significant noise and display the fluorescence lifetimes of the two samples. The most important applications of this technology were demonstrated in BODIPY-based photodynamic therapy, BODIPY probes for lipid membranes, and fluorescent pH sensors based on BODIPY for lipid membranes. The importance of DEXTRAN-TR dye in cell adhesion, tissue differentiation and maintenance, and cell recognition and sorting were also highlighted, in addition to measuring vascular permeability and assessing ionic balance. This technique reveals the unique properties of the studied fluorophores by measuring the fluorescence intensity as a function of light wavelength, thus measuring the time-resolved transient fluorescence at specific wavelengths and then characterizing these fluorophores and extracting their most important properties.

The second chapter of this thesis presents a flexible, precise and reproducible method for fabricating porous polydimethylsiloxane (PDMS) membranes using ultrashort pulse laser ablation, proposed as an alternative to conventional techniques. PDMS membranes with thicknesses of 25, 50 and 100 microm were systematically microdrilled to investigate the influence of key laser parameters - pulse energy and shutter time - on the dimensions, geometry and quality of the resulting holes. Results indicate that pulse energy is the dominant factor affecting pore dimensions, while shutter time above 1000 ms and thicknessplay a secondary role. Higher total energy increases the taper angle of the pores and the extent of the heat-affected zone is directly related to both the laser beam diameter and membrane thickness. A numerical model was developed to simulate the ablation process, incorporating plasma shielding and showing that material removal is strongly pulse energy-dependent. Based on experimental data, an empirical model was also developed to estimate the optimal pulse energy required to fabricate membranes with 10 microm hole diameters and 40 microm spacing. The model predictions showed good agreement with experimental measurements for the exit hole diameters, while larger deviations were observed for entry diameters. Finally, to validate the biological viability of the manufactured membranes, human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were cultured on the laser-processed PDMS films integrated into Organ-on-Chip (OoC) devices. The cells exhibited strong cell adhesion and high metabolic activity, confirming the suitability of this laser-based fabrication method for the development of PDMS membranes in OoC systems.