Proteomic profiling of early migration stages of Fasciola hepatica in experimental models reveals key targets for fasciolosis vaccine development

Abstract

[ES] La fasciolosis es una enfermedad parasitaria causada principalmente por el trematodo Fasciola hepatica. Hay una creciente preocupación a nivel mundial por esta patología, tanto a nivel de salud humana como animal, ya que la capacidad del parásito para infectar a una amplia variedad de hospedadores mamíferos, junto con su adaptabilidad a diversas condiciones climáticas, ha favorecido su expansión a nuevas regiones, impulsada además por el calentamiento global y determinadas prácticas agropecuarias. Reconocida por la Organización Mundial de la Salud como una Enfermedad Tropical Desatendida, la fasciolosis afecta aproximadamente a 17 millones de personas, con más de 90 millones en riesgo. Además, ocasiona importantes pérdidas económicas en la industria ganadera, principalmente ovina y vacuna, estimadas en hasta 3.000 millones de dólares anuales, debido a la disminución de la productividad, la mortalidad y los costes asociados al tratamiento. El tratamiento de la fasciolosis sigue dependiendo del uso de fármacos antihelmínticos. No obstante, la creciente aparición de resistencias compromete su eficacia, lo que convierte el desarrollo de vacunas en una prioridad urgente. A pesar de los avances en el conocimiento de la biología de F. hepatica, las etapas iniciales de la migración del parásito dentro del hospedador vertebrado (definitivo), durante las cuales los vermes juveniles atraviesan la barrera intestinal, se desplazan por la cavidad peritoneal y penetran en el hígado, han sido relativamente poco exploradas a nivel molecular, a pesar de que representan momentos clave para el establecimiento de la infección. En este contexto, una comprensión profunda de las interacciones parásito-hospedador en estas etapas tempranas podría resultar en la identificación de nuevos candidatos vacunales. Actualmente, las tecnologías ómicas de última generación están ampliando significativamente el conocimiento molecular sobre F. hepatica, siendo la proteómica un vínculo esencial entre su genoma y la biología del parásito. En el marco de esta Tesis Doctoral, dicha aproximación ha resultado fundamental para identificar la expresión de proteínas específicas del parásito durante las fases iniciales de la infección en el hospedador definitivo. Se emplearon dos técnicas avanzadas de espectrometría de masas basadas en adquisición de datos independientes (data-independent acquisition, DIA): SWATH-MS (Sequential Window Acquisition of All Theoretical Mass Spectra), que permite la cuantificación reproducible de miles de péptidos, y diaPASEF (Parallel Accumulation–Serial Fragmentation combinado con DIA), que ofrece mayor sensibilidad y velocidad, especialmente útil en muestras con baja concentración de proteínas. La integración de estos análisis proteómicos con el desarrollo de modelos experimentales innovadores que simulan la migración temprana del parásito, también realizados durante esta Tesis Doctoral, permitió alcanzar el objetivo principal de la misma: identificar proteínas clave implicadas en el desarrollo temprano de F. hepatica en el hospedador, con la intención de proponer nuevas dianas vacunales frente a la fasciolosis. Para investigar las adaptaciones moleculares de F. hepatica durante su desarrollo temprano, se estableció un modelo in vivo en ratón de infección oral con las formas de resistencia del parásito (metacercarias). Los parásitos juveniles se recuperaron en dos etapas clave: a las 24 horas post-infección (p.i.) en la cavidad peritoneal, tras atravesar la barrera intestinal, y a los 8 días p.i. en el parénquima hepático, reflejando el inicio de la migración hepática. El perfil proteómico de las fracciones somática y tegumentaria del parásito en estos estadios permitió una caracterización detallada de los cambios dinámicos que experimenta el parásito al migrar en diferentes entornos del hospedador. Los datos revelaron importantes modificaciones en las vías metabólicas, incluida la transición progresiva desde la producción de energía aeróbica hacia mecanismos anaeróbicos, así como la regulación de la maquinaria proteolítica, esencial para la invasión tisular y la evasión del sistema inmunitario, reflejando las adaptaciones fisiológicas que el parásito debe afrontar durante estas fases de la infección. Así mismo, se desarrollaron sistemas de co-cultivo in vitro para estudiar las primeras etapas de la migración a nivel celular en un entorno controlado de laboratorio. Estos modelos fueron diseñados para replicar los ambientes que encuentra el parásito durante la invasión del hospedador, con el objetivo de profundizar en la investigación de las interacciones moleculares, y de reducir el uso de animales de experimentación. Los primeros co-cultivos de los juveniles recién desenquistados de F. hepatica (FhNEJ) con células murinas mesoteliales y estrelladas hepáticas, que representan respectivamente los entornos peritoneal y hepático, mostraron una interacción limitada, ya que los datos proteómicos tanto del parásito como de las células del hospedador revelaron pocos cambios tras la interacción. Esto motivó el desarrollo de un modelo de co-cultivo secuencial que simulase con mayor precisión la ruta natural de migración del parásito. En este modelo, los co-cultivos de FhNEJ con células epiteliales intestinales y, posteriormente, con células mesoteliales, revelaron adaptaciones proteómicas diferenciadas. El contacto previo con el epitelio intestinal desencadenó una respuesta específica y dependiente del tipo celular, ausente o atenuada en presencia de las células mesoteliales, donde los cambios proteómicos fueron más limitados o enmascarados. Los datos proteómicos obtenidos se integraron con información ómica previamente publicada en modelos complementarios para identificar candidatos vacunales en las etapas tempranas del desarrollo de F. hepatica. De este modo, las proteínas catepsina B3 (FhCB3), legumina 1 (FhLeg1) y serpina 1 (FhSrp1) fueron seleccionadas por su relevancia durante la migración inicial del parásito. El análisis in silico predijo su inmunogenicidad y propiedades estructurales, mientras que los ensayos de inmunofluorescencia confirmaron su localización en el tegumento del parásito. Para profundizar en la relevancia funcional de estos antígenos, se desarrolló una innovadora metodología de edición genética basada en CRISPR-Cas, que sienta las bases para futuros ensayos orientados a evaluar el potencial vacunal de diversas dianas parasitarias a travésde su estudio directo de su papel en la biología del parásito. En definitiva, esta Tesis Doctoral aporta nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo temprano de F. hepatica y su interacción con el hospedador. La integración de enfoques proteómicos, modelos experimentales y análisis bioinformáticos permitió identificar antígenos clave con potencial vacunal, abriendo nuevas vías para el control eficaz de la fasciolosis.

[EN] Fasciolosis is a parasitic disease caused primarily by the trematode Fasciola hepatica. There is a growing global concern about this pathology, both in human and animal health, as the parasite's ability to infect a wide variety of mammalian hosts, along with its adaptability to diverse climatic conditions, has favored its expansion to new regions, further driven by global warming and certain agricultural practices. Recognized by the World Health Organization as a Neglected Tropical Disease, fasciolosis affects approximately 17 million people, with more than 90 million at risk. It also causes significant economic losses in the livestock industry, primarily sheep and cattle, estimated at up to $3 billion annually, due to decreased productivity, mortality, and associated treatment costs. Treatment of fascioliasis continues to rely on the use of anthelmintic drugs. However, the increasing emergence of resistance compromises their efficacy, making vaccine development an urgent priority. Despite advances in our understanding of F. hepatica biology, the initial stages of parasite migration within the vertebrate (definitive) host—during which juvenile worms cross the intestinal barrier, move through the peritoneal cavity, and enter the liver—have been relatively poorly explored at the molecular level, despite representing key moments for the establishment of infection. In this context, a thorough understanding of parasite-host interactions at these early stages could lead to the identification of new vaccine candidates. Currently, cutting-edge omics technologies are significantly expanding molecular knowledge about F. hepatica, with proteomics being an essential link between its genome and the parasite's biology. Within the framework of this PhD thesis, this approach has been essential to identify the expression of parasite-specific proteins during the initial stages of infection in the definitive host. Two advanced mass spectrometry techniques based on data-independent acquisition (DIA) were employed: SWATH-MS (Sequential Window Acquisition of All Theoretical Mass Spectra), which allows the reproducible quantification of thousands of peptides, and diaPASEF (Parallel Accumulation–Serial Fragmentation combined with DIA), which offers greater sensitivity and speed, especially useful in samples with low protein concentrations. The integration of these proteomic analyses with the development of innovative experimental models that simulate early parasite migration, also conducted during this PhD thesis, allowed us to achieve the main objective of this thesis: to identify key proteins involved in the early development of F. hepatica in the host, with the aim of proposing new vaccine targets against fasciolosis. To investigate the molecular adaptations of F. hepatica during its early development, an in vivo mouse model of oral infection with resistant forms of the parasite (metacercariae) was established. Juvenile parasites were recovered at two key stages: 24 hours post-infection (p.i.) in the peritoneal cavity, after crossing the intestinal barrier, and 8 days p.i. in the liver parenchyma, reflecting the onset of liver migration. Proteomic profiling of the somatic and tegumentary fractions of the parasite at these stages allowed a detailed characterization of the dynamic changes the parasite undergoes as it migrates through different host environments. The data revealed significant modifications in metabolic pathways, including the progressive transition from aerobic to anaerobic energy production, as well as the regulation of the proteolytic machinery, essential for tissue invasion and immune system evasion, reflecting the physiological adaptations the parasite must undergo during these stages of infection. In vitro co-culture systems were also developed to study the early stages of migration at the cellular level in a controlled laboratory setting. These models were designed to replicate the environments encountered by the parasite during host invasion, with the aim of furthering the investigation of molecular interactions and reducing the use of experimental animals. Initial co-cultures of newly excysted juvenile F. hepatica (FhNEJ) with murine mesothelial or hepatic stellate cells, representing the peritoneal and hepatic environments, respectively, showed limited interaction, as proteomic data from both the parasite and host cells revealed few changes following interaction. This prompted the development of a sequential co-culture model that more accurately simulated the parasite's natural migration route. In this model, co-cultures of FhNEJ with intestinal epithelial cells and, subsequently, with mesothelial cells revealed distinct proteomic adaptations. Prior contact with the intestinal epithelium triggered a cell-type-specific response, which was absent or attenuated in the presence of mesothelial cells, where proteomic changes were more limited or masked. The proteomic data obtained were integrated with previously published omics information in complementary models to identify vaccine candidates in the early stages of F. hepatica development. Thus, the proteins cathepsin B3 (FhCB3), legumin 1 (FhLeg1), and serpin 1 (FhSrp1) were selected for their relevance during the initial migration of the parasite. In silico analysis predicted their immunogenicity and structural properties, while immunofluorescence assays confirmed their localization in the parasite tegument. To further investigate the functional relevance of these antigens, an innovative CRISPR-Cas-based gene editing methodology was developed, which lays the groundwork for future trials aimed at evaluating the vaccine potential of various parasitic targets by directly studying their role in parasite biology. Ultimately, this doctoral thesis provides new insights into the molecular mechanisms involved in the early development of F. hepatica and its interaction with the host. The integration of proteomic approaches, experimental models, and bioinformatics analyses has allowed us to identify key antigens with vaccine potential, opening new avenues for effective control of fascioliasis.