Vacuna de ARNm frente a Fasciola hepatica basada en un diseño multiepítopo

Abstract

[ES] En la introducción de esta tesis doctoral se discute la importancia de la fasciolosis, enfermedad causada por el trematodo Fasciola hepatica y se contextualiza como un problema de salud pública y veterinaria. La aparición de resistencias al triclabendazol, único fármaco eficaz, apremia a desarrollar una vacuna que proteja frente a la infección por el parásito. Con este objetivo en mente, se revisa el ciclo biológico del parásito y su organización genómica, transcriptómica y proteómica. Se incide principalmente en el arsenal de proteínas involucradas en las diferentes fases parasitarias con funciones especializadas en la invasión, la nutrición y la evasión inmune. Se describe cómo el parásito redirige activamente la respuesta del hospedador desde un perfil Th1 inicial hacia un entorno Th2/Treg permisivo.

Posteriormente se revisa la evolución de las estrategias vacunales, desde las vacunas de primera generación hasta las de subunidades y ADN. Se discuten los criterios de selección de antígenos, las vacunas de antígenos múltiples y epítopos, el papel del adyuvante y los resultados obtenidos en distintos modelos animales, que han sido heterogéneos y no han conducido a una vacuna comercial.

Finalmente, se presenta la plataforma de vacunas de ARNm y su impacto reciente en el desarrollo de las vacunas del SARS-CoV-2. Se detallan sus mecanismos moleculares y el diseño de los vectores, los sistemas de encapsulación en nanopartículas lipídicas, los mecanismos de activación de la respuesta inmune innata y adaptativa y se discuten las ventajas de esta tecnología y cómo podría aplicarse a vacunas contra parásitos.

Con estos antecedentes nos propusimos el objetivo de desarrollar una vacuna eficaz contra Fasciola hepatica que integre la tecnología del ARN mensajero y utilice múltiples epítopos T. Para ello, en primer lugar, nos planteamos poner a punto una nueva tecnología (vacunas de ARNm) aún no ensayada como vacuna en fasciolosis, con la finalidad de evaluar su correcta expresión y posterior traducción. En la primera publicación demostramos que el ARNm de la proteína de unión a ácidos grasos Fh15, se expresa correctamente y encapsulada en nanopartículas lipídicas es capaz de generar respuesta inmune innata, adaptativa por células T y humoral específica contra la proteína. Eso nos llevó a nuestro segundo objetivo que fue diseñar construcciones que incluyera múltiples epítopos T en ARNm. Para ello, deberíamos en primer lugar explorar el genoma y transcriptoma de Fasciola hepatica en busca de proteínas con alta expresión en las diferentes fases parasitarias. De esta manera, seleccionamos 55 epítopos que eran los más favorables según su constante de unión al MHC-II y su perfil de seguridad. Se diseñaron múltiples construcciones utilizando estos epítopos y aunque se demostró que la polimerasa SP6 era muy superior a la T7 realizando sus transcripciones, estos ARNm no se expresaban correctamente en células de mamífero. Nos planteamos utilizar construcciones más pequeñas y acoplar una proteína carrier que ayudara a estabilizarlas. Así, logramos que se expresaran correctamente, demostrando la posibilidad de construir una vacuna multiepítopo mediante tecnología de ARNm.

Una vez conseguido este reto, nos propusimos evaluar su eficacia utilizando un modelo experimental murino de infección con Fasciola hepatica. Para ello desarrollamos la vacuna denominada gFh3Tq encapsulando un ARN mensajero que codificaba tres péptidos T estabilizados mediante la proteína eGFP. Los ratones vacunados mostraron un perfil de citoquinas Th1 y Th17, además de linfocitos T CD4⁺ y CD8⁺ efectores de memoria terminalmente diferenciados. Además, los ratones vacunados mostraron una supervivencia del 67% y una reducción de carga parasitaria del 71%. Por tanto, se demostraba que una vacuna de ARNm multiepítopo era un candidato vacunal contra la infección por Fasciola hepatica y que futuros estudios debían ir encaminados a probar esta vacuna en hospedadores naturales.

[EN] The introduction of this doctoral thesis discusses the importance of fasciolosis, a disease caused by the trematode Fasciola hepatica, and contextualizes it as a public health and veterinary problem. The emergence of resistance to triclabendazole, the only effective drug, urges the development of a vaccine to protect against infection by the parasite. With this goal in mind, the parasite's life cycle and its genomic, transcriptomic, and proteomic organization are reviewed. Emphasis is placed primarily on the arsenal of proteins involved in the different parasitic stages with specialized functions in invasion, nutrition, and immune evasion. It is described how the parasite actively redirects the host response from an initial Th1 profile toward a permissive Th2/Treg environment.

Subsequently, the evolution of vaccine strategies is reviewed, from first-generation vaccines to subunit and DNA vaccines. The criteria for antigen selection, multi-antigen and epitope-based vaccines, the role of the adjuvant, and the results obtained in different animal models are discussed, which have been heterogeneous and have not led to a commercial vaccine.

Finally, the mRNA vaccine platform and its recent impact on the development of SARS-CoV-2 vaccines are presented. Its molecular mechanisms and vector design, lipid nanoparticle encapsulation systems, and mechanisms of innate and adaptive immune response activation are detailed, and the advantages of this technology and how it could be applied to vaccines against parasites are discussed.

With this background, we set out to develop an effective vaccine against Fasciola hepatica that integrates messenger RNA technology and uses multiple T-cell epitopes. To this end, we first aimed to optimize a new technology (mRNA vaccines) not yet tested as a vaccine in fasciolosis, in order to evaluate its correct expression and subsequent translation. In the first publication, we demonstrated that the mRNA encoding the fatty acid-binding protein Fh15 is correctly expressed and, when encapsulated in lipid nanoparticles, produces innate immune responses, adaptive T-cell responses, and specific humoral responses against the protein.

This led us to our second objective, which was to design constructs incorporating multiple T-cell epitopes in mRNA. To achieve this, we first needed to explore the genome and transcriptome of Fasciola hepatica in search of proteins with high expression across the different parasitic stages. In this way, we selected 55 epitopes that were the most favorable based on their binding affinity to MHC-II and their safety profile. Multiple constructs were designed using these epitopes, and although it was demonstrated that SP6 polymerase was far superior to T7 in performing their transcriptions, these mRNAs were not correctly expressed in mammalian cells. We decided to use smaller constructs and couple a carrier protein to help stabilize them. Thus, we achieved their correct expression, demonstrating the feasibility of constructing a multi-epitope vaccine using mRNA technology.

Once this challenge was accomplished, we set out to evaluate its efficacy using a murine experimental model of Fasciola hepatica infection. To this end, we developed the vaccine designated gFh3Tq by encapsulating a messenger RNA encoding three T-cell peptides stabilized by the eGFP protein. Vaccinated mice displayed a Th1 and Th17 cytokine profile as well as terminally differentiated effector memory CD4+ and CD8+ T lymphocytes. Furthermore, vaccinated mice showed 67% survival and a 71% reduction in parasite burden. Therefore, it was demonstrated that a multi-epitope mRNA vaccine was a vaccine candidate against Fasciola hepatica infection and that future studies should be directed toward testing this vaccine in natural hosts.