Estudio de Bgs1p y Bgs4p: dos proteínas esenciales implicadas en la biosíntesis del β(1-3)-D-glucano de Schizosaccharomyces pombe

Abstract

[ES]El establecimiento del sitio de división en Schizosaccharomyces pombe depende de la formación de un anillo medio contráctil y de la acumulación de los parches de F-actina a su alrededor. Al final de la anafase comienza la contracción del anillo y la síntesis centrípeta del septo de división, el cual está compuesto por un disco central de beta(1-3)-D-glucano lineal, denominado septo primario, y por una estructura similar a la de la pared celular a ambos lados del mismo, denominada septo secundario, y cuya síntesis es esencial para la integridad celular. Últimamente ha aumentado considerablemente la información sobre la formación y la activación de la contracción del anillo medio. Sin embargo, aún no se conoce cómo se produce la síntesis del septo. S. pombe posee cuatro posibles subunidades catalíticas del complejo beta(1-3)-D-glucán sintasa (BGS), denominadas Bgs1p-4p. En esta tesis hemos estudiado la función de Bgs1p y Bgs4p en la síntesis del beta-glucano y su importancia para la formación del septo durante la citocinesis y el mantenimiento de la integridad celular.

La proteína Bgs1p/Cps1p ha sido identificada como una hipotética subunidad catalítica de la (BGS), con una posible función durante la citocinesis y el crecimiento polarizado. Para estudiar esta posibilidad, se crearon mutantes dobles de cps1-12 y diferentes mutantes cdc de septación. Los mutantes dobles obtenidos presentaron distintos fenotipos de hipersensibilidad y alteraciones en la distribución de la actina. El análisis de las relaciones epistáticas de los mutantes dobles mostró que las mutaciones de los procesos anteriores a la síntesis del septo eran dominantes sobre cps1-12, mientras que cps1-12 era dominante sobre el mutante de finalización de la septación cdc16-116, lo que sugiere que Bgs1p está implicada en la síntesis del beta(1-3)-D-glucano de la pared celular del septo durante la citocinesis. Hemos estudiado la localización fisiológica in vivo de Bgs1p en una estirpe bgs1D que contiene un gen GFP-bgs1+ funcional (una única copia integrada del gen y expresada bajo el control de su propio promotor). Durante el crecimiento vegetativo, Bgs1p siempre se localiza en las zonas de crecimiento: en uno ó ambos polos durante el crecimiento celular, y en el anillo medio y septo durante la citocinesis. La localización de Bgs1p en los mutantes cdc de septación indica que Bgs1p necesita las proteínas del anillo medio y de la ruta de activación de la septación (SIN) para localizarse correctamente con el resto de los componentes de la septación. La localización de Bgs1p en el mutante de actina cps8-188 muestra que la localización de Bgs1p depende de la localización de la actina. Además, Bgs1p permanece polarizada en los polos y septos deslocalizados de los mutantes tea1-1 y tea2-1. Durante el proceso meiótico del ciclo de vida, Bgs1p se localiza en las proyecciones de conjugación, en la zona de contacto entre las células durante la fusión celular y en el área del cuello durante la formación del cigoto. También, la localización de Bgs1p sugiere que colabora en la síntesis de la pared de la proespora y de la espora. Durante la germinación de la espora, Bgs1p se localiza primero alrededor de la espora durante el crecimiento isotrópico, a continuación, en la zona de crecimiento polarizado y finalmente, en el anillo medio y septo. Al final de la división entre la espora y la célula, el desplazamiento de Bgs1p hacía el polo viejo ocurre únicamente en la célula. Todos estos datos muestran que Bgs1p se localiza en las áreas de crecimiento polarizado de la pared celular, y por lo tanto, proponemos que Bgs1p podría estar implicada en la síntesis del beta(1-3)-D-glucano lineal del septo primario, así como de un beta(1-3)-D-glucano linear similar, que podría ser necesario en otros procesos de crecimiento ó de reparación de la pared celular.

También hemos estudiado la función de Bgs1p y demostramos que es la subunidad de una actividad BGS, responsable de la síntesis del beta(1-3)-D-glucano lineal y del septo primario que origina. Hemos analizado el efecto letal que produce la represión de la expresión de bgs1+ en un fondo genético bgs1D. Para ello, hemos construido una serie de vectores que expresan bgs1+ bajo el control del promotor reprimible por tiamina nmt1+-81X, y que abarcan un rango de represión de aproximadamente 500 veces. Al reprimir la expresión de bgs1+ las células siguen presentando un fenotipo silvestre incluso cuando los niveles de Bgs1p son ya indetectables indicando el nivel tan bajo de Bgs1p que necesitan las células. La represión de bgs1+ sólo muestra un fenotipo letal con los tres vectores con mayor nivel de represión, originando células ramificadas y con múltiples septos, lo que demuestra que Bgs1p tiene un papel esencial durante la septación. La represión ó la sobreexpresión de bgs1+ no muestra ninguna alteración del beta-glucano, pero sí un aumento considerable del beta-glucano de la pared celular. Sin embargo, la actividad BGS disminuye en ambos casos. Por otro lado, las células con niveles reducidos de Bgs1p muestran un incremento notable de Bgs3p. Estos resultados sugieren que Bgs1p forma parte de un complejo multiproteico de la actividad BGS, y que las alteraciones producidas por las variaciones de Bgs1p inducen procesos compensatorios de otras subunidades Bgs y de la alfa(1-3)-D-glucán sintasa (AGS). El análisis de la represión de bgs1+ mediante tinción con Calcofluor white, un compuesto fluorescente que marca específicamente las zonas de crecimiento de la pared celular (polos y septo), y mediante marcaje con anticuerpos monoclonales específicos contra el beta(1-3)-D-glucano lineal, muestra en ambos casos, una reducción de la tinción de los septos. Los estudios mediante microscopía electrónica de transmisión y mediante inmunomicroscopía electrónica confirman que los septos presentan grandes alteraciones en su estructura, debidas principalmente a los defectos ó a la ausencia del septo primario y del beta(1-3)-D-glucano lineal del mismo. La deleción de bgs1+ es letal, pero las esporas bgs1D son capaces de germinar y originar células que pueden crecer durante varios ciclos mitóticos hasta morirse, dando lugar a células gigantes, multiseptadas y ramificadas. Estas células son parecidas a las observadas durante la represión de bgs1+, pero carecen completamente del septo primario y del beta(1-3)-D-glucano lineal, y no se tiñen con el Calcofluor. Todos estos datos muestran que el septo primario no es necesario para la síntesis del septo, que Bgs1p es responsable de la síntesis del beta(1-3)-D-glucano lineal y que éste a su vez es responsable de la estructura del septo primario, y que el polisacárido de la pared celular que reconoce específicamente y con una alta afinidad el Calcofluor es el beta(1-3)-D-glucano lineal.

Finalmente, en esta tesis hemos clonado bgs4+ y mostramos que Bgs4p es la única subunidad que se ha encontrado hasta la fecha que forma parte de la enzima BGS y que es esencial para mantener la integridad celular durante la citocinesis y el crecimiento polarizado. También mostramos que bgs4+, cwg1+ (cwg1-1 presenta una reducción del beta-glucano de la pared celular y de la actividad catalítica de la BGS) y orb11+ (orb11-59 está alterado en la morfogénesis celular) son el mismo gen. bgs4+ es esencial para la germinación de la espora. En células vegetativas la represión de la expresión de bgs4+ produce la lisis celular en los polos de crecimiento y principalmente en el septo, antes de la separación celular, lo que sugiere que Bgs4p es esencial para el crecimiento de la pared celular y para compensar un exceso de degradación de la pared celular durante la citocinesis. El análisis de la represión y de la sobreexpresión de bgs4+ sugiere que Bgs4p forma parte de un complejo catalítico multiproteico de la BGS, y que las alteraciones del beta-glucano de la pared celular producidas por las variaciones de Bgs4p inducen mecanismos compensatorios a través de las otras subunidades Bgs y de la AGS. Los estudios de localización en condiciones fisiológicas mostraron que Bgs4p se localiza en los polos de crecimiento, el anillo medio, el septo y en cada uno de los sitios donde se produce síntesis ó remodelación de la pared celular durante la diferenciación sexual: conjugación, formación del cigoto y de la espora, y germinación de la espora. Los requerimientos para una correcta localización de Bgs4p durante la citocinesis, así como el patrón de localización de Bgs4p durante la maduración de la espora, difieren de los de Bgs1p. Bgs4p aparece en el anillo contráctil después de que se detecte Bgs1p y un material del septo teñido por el Calcofluor white, sugiriendo que Bgs4p está implicada en un proceso posterior, de síntesis del septo secundario ó de todo el septo en general. A diferencia de Bgs1p, Bgs4p necesita el anillo medio pero no las proteínas de la ruta de activación de la septación (SIN) para localizarse con los otros componentes de la septación. Además, la localización de Bgs4p depende de las proteínas del establecimiento de la polaridad. Finalmente, Bgs4p depende de la F-actina para su deslocalización de las zonas de crecimiento y su relocalización en las mismas, pero no necesita la actina para mantenerse estable en los sitios de crecimiento, polos y septo. Todos estos resultados muestran, por primera vez, el papel esencial de una subunidad Bgs en la síntesis de un beta(1-3)-D-glucano, que es necesario para preservar la integridad de la célula durante la síntesis ó reparación de la pared celular.