Analysis of the role of Cdc14/Flp1 in checkpoint response to genotoxic stress in "Schizosaccharomyces pombe"

Abstract

[ES]El estudio presentado en esta Tesis Doctoral se centra en la investigación de la función de la fosfatasa Flp1p de Schizosaccharomyces pombe (también conocida como Clp1p), perteneciente a la familia Cdc14, en los mecanismos de vigilancia celular, especialmente en la cascada de señalización en respuesta al estrés replicativo y al daño en el DNA. Para ello se llevaron a cabo análisis genéticos y bioquímicos comparados de las mencionadas respuestas en cepas silvestres y mutadas para flp1, así como estudios de la expresión génica en respuesta a estrés. En el marco de esta tesis se está desarrollando así mismo un modelo matemático del checkpoint de replicación en colaboración con el grupo de Biología Computacional de Sistemas del Instituto Max Planck de Genética Molecular de Berlín, Alemania.En esta Tesis Doctoral se ha demostrado la estrecha relación de Flp1p de S. pombe, con la quinasa Cds1p (principal efector del checkpoint de replicación) en situaciones de estrés replicativo y se describe por primera vez la implicación de Flp1p en el checkpoint de replicación. La respuesta celular a estrés replicativo produce la salida de Flp1p al núcleo, muy probablemente por medio de fosforilación directa de la fosfatasa por Cds1p. Por otra parte la actividad de Cds1p en respuesta al checkpoint se ve reducida en células delecionadas para Flp1p. La alteración de los niveles proteicos de Flp1p o de su localización resulta en la desregulación de la respuesta a estrés, produciéndose efectos como pérdida de eficiencia en el bloqueo de la progresión celular o la aparición de focos de recombinación. Todas estas evidencias apuntan a que Flp1p participa en la (auto-) regulación del grado de activación del checkpoint de replicación necesario para una respuesta celular adecuada en situaciones de estrés replicativo.

[EN]This PhD thesis has concentrated on the investigation of the function of the Schizosaccharomyces pombe phosphatase Flp1p (also known as Clp1p), member of the Cdc14 family, in checkpoint response to replication stress and DNA damage. The behaviour of flp1 mutants in response to DNA stress was compared to that of wt strains by means of different biochemical and genetical analyses including a high-throughput analysis of their specific transcriptional response to replication stress. In addition, a mathematical model of the replication checkpoint in S. pombe has been developed in the framework of this thesis in collaboration with the Computational Systems Biology Group of the Max Planck Institute for Molecular Genetics of Berlin, Germany.This study has revealed the close interplay of Flp1p and Cds1p (main effector of the replication checkpoint) under replication stress and has described for the first time the implication of Flp1p in the replication checkpoint signalling cascade. Cellular response to replication stress triggers localization of Flp1p to the nucleus, most probably by direct phosphorylation of the phosphatase by Cds1p. On the other hand, Cds1p activity in response to replication stress is reduced in cells deleted for flp1. Altered protein levels of Flp1p or mislocalization results in deregulation of checkpoint response to replication stress, such as loss of efficiency in cell cycle block or accumulation of recombination foci. All these evidences point to an implication of Flp1p in an (auto-) regulatory mechanism to achieve the adequate degree of checkpoint activation necessary for a proficient cellular response to replication stress.