2026-09-16T09:17:12Zhttps://gredos.usal.es/oai/requestoai:gredos.usal.es:10366/1242282025-06-05T12:40:28Zcom_10366_4756com_10366_4746com_10366_3823col_10366_68520
Desarrollo de nuevos sistemas para el cambio de escala en cromatografía de afinidad
Vega Moreno, Milena Amparo
Martín del Valle, Eva María
Galán Salvador, Arturo
[ES] Dentro de los procesos downstream de separación de proteínas, la
cromatografía de afinidad con metales inmovilizados es una técnica muy utilizada
porque el coste es relativamente más bajo que la cromatografía de afinidad
convencional y por la posibilidad de llevar a cabo el proceso a escala industrial.
Tradicionalmente, estos procesos de separación de biomoléculas, se llevan a
cabo en columnas empaquetadas con material en forma de partículas porosas.
Sin embargo este tipo de matrices presentan inconvenientes al llevar los procesos
de separación a nivel industrial, debido a que presentan una alta pérdida de carga,
obligando a diseñar columnas de gran diámetro y altura reducida.
Es por esta razón, que el objetivo de este trabajo es desarrollar una nueva
forma de separación de proteínas basada en la técnica IMAC, utilizando como
matriz cromatográfica un monolito cerámico multicanal, que permita el paso de la
fase líquida que contiene la biomolécula a separar a través de los canales del
mismo facilitando el movimiento dentro del soporte y disminuyendo
considerablemente la pérdida de carga.
Como sistema inicial de estudio, se propuso un monolito cerámico recubierto
con agarosa tipo D-5, activado con 1,4 butanodiol-diglicidil-éter como brazo
espaciador, ácido iminodiacético (IDA) como agente quelante y Cu2+ como
ligando.
Asimismo, la proteína tipo empleada para establecer las condiciones del
proceso fue el suero de albúmina bovina (BSA). Posteriormente se estudió el
proceso de adsorción de la enzima catalasa (CAT), para finalmente llevar a cabo la
separación de una mezcla binaria (BSA+CA).
Los objetivos de este trabajo se centraron en primer lugar en la determinación
de la eficiencia de la matriz cromatográfica, es decir, el monolito cerámico
recubierto de agarosa D5 y activado, debido a que es un factor clave para la
economía del proceso de adsorción.
Para este fin, la eficiencia de los ciclos de adsorción fueron determinados
mediante el desarrollo de un modelo dinámico, que estudia la reutilización óptima
del soporte cerámico. En primer lugar se estudió el proceso de adsorción de la
proteína BSA en solución fosfato pH 4,5, a cinco caudales (1,50, 5,50, 8,40, 10,60
y 14,00 cm3/min), llevando a cabo cinco ciclos de adsorción/elución, utilizando
una misma matriz monolítica. De este estudio se pudo comprobar que, utilizando
un mismo caudal en el proceso de adsorción, el tiempo necesario para que el
sistema alcanzara el equilibrio, era prácticamente el mismo en todos los ciclos.
También se observó, que a medida que aumentaba el caudal en el proceso de
adsorción, el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio era menor y que a
medida que aumentaba el caudal, la capacidad de adsorción de la columna
monolítica también aumentaba.
Los experimentos de elución, se llevaron a cabo por medio de un agente
competitivo, el imidazol donde se obtuvo un porcentaje de recuperación de
proteína enlazada específicamente, en torno al 95%. Y después del proceso de
elución, la columna monolítica es acondicionada para el siguiente ciclo de
adsorción por medio de un lavado con tampón tris-HCl pH 8,0.
Una vez estudiado el proceso de adsorción de la proteína BSA en solución
fosfato pH 4,5, y determinado que el caudal de 14,00 cm3/min, era el que mejor
resultado presentaba en cuanto a tiempo de equilibrio y cantidad de proteína
adsorbida para las condiciones de trabajo propuestas, se procedió a estudiar el
efecto del pH, llevando a cabo el proceso de adsorción de la proteína BSA en
tampón fosfato pH 7,0. Así, de forma general se pudo establecer que
independientemente del pH utilizado, a un caudal de 14 cm3/min, el tiempo
necesario para que el proceso de adsorción alcance el equilibrio es prácticamente el
mismo, y que la capacidad de adsorción de la matriz es ligeramente mayor con
respecto a los experimentos en solución fosfato pH 4,5 a un caudal de 14,00
cm3/min respectivamente.
2013-11-22
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
spa
http://hdl.handle.net/10366/124228
https://gredos.usal.es/bitstream/10366/124228/4/DIQT_VegaMoreno_MileniaAmparo_Tesis.pdf.pdf.txt
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Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Academic Dissertations
Ingeniería y tecnología químicas
Separación química
Procesos químicos
10.14201/gredos.124228