2026-09-15T23:18:15Zhttps://gredos.usal.es/oai/requestoai:gredos.usal.es:10366/1582792025-04-30T20:48:09Zcom_10366_110570com_10366_4576com_10366_3823com_10366_122445com_10366_4746com_10366_143088com_10366_123103col_10366_110577col_10366_122446col_10366_143112
Pineda Santaella, Alberto
2024-06-13T12:15:38Z
2024-06-13T12:15:38Z
2023
http://hdl.handle.net/10366/158279
[EN] Centrosomes are the major microtubule-organizing centres in eukaryotic cells. In mitosis and male meiosis, centrosomes
nucleate and organize the microtubules that build up the spindle, the macromollecular apparatus that generates and
guides the physical forces needed to segregate chromosomes into daughter cells. Contrarily, in female meiosis of most
metazoa, the female progenitor cell actively eliminate centrosomes before or during meiotic divisions. Consequently, the
meiotic spindle assembles and segregates chromosomes without the guidance of centrosomes (‘acentrosomal spindle’).
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe is excellent to study meiosis, although it maintains the SPBs (fungal equivalent
of centrosomes) in meiosis and so, the meiotic spindle is still mediated by the SPBs in this organism (‘SPB-mediated
spindle’). This difference with female metazoan meiosis limits the potential of this yeast for studying the molecular basis
underlying the acentrosomal spindle, interesting to understand the meiotic errors affecting human fertility and health.
In our lab, we generated a fission yeast system (bqt1Δ sad1.2) where SPBs are dislodged from the nuclear envelope, so
that the SPB-dependent spindle formation is abolished. Here, we observe a microtubule array with spindle-like morphology
and dynamics and chromosome segregation capability despite the dislodgement of SPBs, hypothesizing that
this structure is a self-assembled spindle, independent of SPBs in fission yeast meiosis in analogy with the acentrosomal
spindle independent of centrosomes in female metazoan meiosis. In this doctoral thesis, we explore the possibility of
such type of spindle, optimizing the experimental conditions for its formation and study. We confirm the formation of
the self-assembled spindle independently of the SPBs and validate this by reproducing it through alterative genotypes.
Also, we describe that its assembly depends on the microtubule polymerizer and nucleator Alp14/XMAP215 and that
the microtubule crosslinker Ase1/PRC1 is necessary to maintain its structural integrity during elongation. However,
its formation is majorly independent of the γ-tubulin complex activity, instead depending on mechanisms conserved in
metazoa, crutial for acentrosomal spindle formation, such as the kinetochore pathway and the RanGTP gradient. Further,
we improve its structural robustness and fidelity of chromosome segregation by stabilizing microtubules via the
elimination of Kinesin-8, especifically Klp6 but not Klp5. Lastly, we standarized our methodology for self-assembled
spindle obention, observation through fluorescence microscopy timelapse and analysis, enabling a deeper characterization
of spindle assembly, elongation dynamics and chromosome segregation.
[ES] Los centrosomas son los principales centros organizadores de microtúbulos en las células eucariotas. En mitosis y meiosis
masculina, los centrosomas nuclean y organizan los microtúbulos que construyen el huso, el aparato macromolecular
que genera y guía las fuerzas físicas necesarias para segregar los cromosomas en las células hijas. Por el contrario, en la
meiosis femenina de la mayoría de metazoos, la célula progenitora femenina activamente elimina los centrosomas antes
o durante las divisiones meióticas. Consecuentemente, el huso meiótico se ensambla y segrega cromosomas en ausencia
de la guía de los centrosomas (‘huso acentrosómico). La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe es excelente para
estudiar la meiosis, aunque esta mantiene los SPBs (equivalentes fúngicos de los centrosomas) en meiosis y, entonces, el
huso meiótico sigue siendo mediado por los SPBs en este organismo (’huso dependiente de SPB’). Esta diferencia con la
meiosis femenina de metazoos limita el potencial de esta levadura para estudiar la base molecular subyacente al huso
acentrosómico, interesante para entender los errores meioóticos que afectan a la fertilidad y salud humanas.
En nuestro laboratorio, hemos generado un sistema de levadura de fisión (bqt1Δ sad1.2) en el que los SPBs están aislados
de la envoltura nuclear, de tal forma que la formación huso dependiente de SPBs está abolida. Aquí, observamos un
array de microtúbulos con una morfología y dinámicas típicas de un huso y capacidad de segregación de cromosomas
a pesar del aislamiento de los SPBs, hipotetizando que esta estructura es un huso autoensamblado, independiente de
los SPBs en la meiosis de la levadura de fisión, análogo al huso acentrosómico independiente de los centrosomas en la
meiosis femenina de metazoos. En esta tesis doctoral, exploramos la posibilidad de dicho tipo de huso, optimizando
las condiciones experimentales para su formación y estudio. Confirmamos la formación del huso autoensamblado independientemente
de los SPBs y validamos esto reproduciéndola mediante genotipos alternativos. También, describimos
que su ensamblaje depende del polimerizador y nucleador de microtúbulos Alp14/XMAP215 y que el entrecruzador de
microtúbulos Ase1/PRC1 es necesario para mantener su integridad estructural durante su elongación. Sin embargo, su
formación es mayormente independiente de la actividad del complejo de γ-tubulina y, en su lugar, depende de mecanismos
conservados en metazoos, cruciales para la formación del huso acentrosómico, como la ruta del quinetocoro y
el gradiente de RanGTP. Más allá, mejoramos su robustez estructural y fidelidad de segregación de cromosomas con
la eliminación de la Quinesina-8, específicamente Klp6 pero no Klp5. Por último, estandarizamos nuestra metodología
para la obtención, observación por videomicroscopía de fluorescencia y análisis del huso autoensamblado, lo cual permitió
una caracterización más en detalle de su ensamblaje, dinámica de elongación y segregación de cromosomas.
eng
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
info:eu-repo/semantics/openAccess
Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional
Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Meiosis
Cromosomas
Characterization and improvement of a self-assembled spindle in fission yeast meiosis
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis