2026-09-14T06:02:08Zhttps://gredos.usal.es/oai/requestoai:gredos.usal.es:10366/1699922026-02-26T05:10:48Zcom_10366_4756com_10366_4746com_10366_3823com_10366_137532com_10366_4576com_10366_143089com_10366_123103col_10366_68517col_10366_137534col_10366_143124
López García, Marta
2026-02-24T09:36:04Z
2026-02-24T09:36:04Z
2025
http://hdl.handle.net/10366/169992
10.14201/gredos.169992
[ES] La fasciolosis es una enfermedad parasitaria causada principalmente por el
trematodo Fasciola hepatica. Hay una creciente preocupación a nivel mundial por esta
patología, tanto a nivel de salud humana como animal, ya que la capacidad del parásito
para infectar a una amplia variedad de hospedadores mamíferos, junto con su
adaptabilidad a diversas condiciones climáticas, ha favorecido su expansión a nuevas
regiones, impulsada además por el calentamiento global y determinadas prácticas
agropecuarias. Reconocida por la Organización Mundial de la Salud como una
Enfermedad Tropical Desatendida, la fasciolosis afecta aproximadamente a 17 millones
de personas, con más de 90 millones en riesgo. Además, ocasiona importantes pérdidas
económicas en la industria ganadera, principalmente ovina y vacuna, estimadas en hasta
3.000 millones de dólares anuales, debido a la disminución de la productividad, la
mortalidad y los costes asociados al tratamiento.
El tratamiento de la fasciolosis sigue dependiendo del uso de fármacos
antihelmínticos. No obstante, la creciente aparición de resistencias compromete su
eficacia, lo que convierte el desarrollo de vacunas en una prioridad urgente. A pesar de
los avances en el conocimiento de la biología de F. hepatica, las etapas iniciales de la
migración del parásito dentro del hospedador vertebrado (definitivo), durante las cuales
los vermes juveniles atraviesan la barrera intestinal, se desplazan por la cavidad peritoneal
y penetran en el hígado, han sido relativamente poco exploradas a nivel molecular, a pesar
de que representan momentos clave para el establecimiento de la infección. En este
contexto, una comprensión profunda de las interacciones parásito-hospedador en estas
etapas tempranas podría resultar en la identificación de nuevos candidatos vacunales.
Actualmente, las tecnologías ómicas de última generación están ampliando
significativamente el conocimiento molecular sobre F. hepatica, siendo la proteómica un
vínculo esencial entre su genoma y la biología del parásito. En el marco de esta Tesis
Doctoral, dicha aproximación ha resultado fundamental para identificar la expresión de
proteínas específicas del parásito durante las fases iniciales de la infección en el
hospedador definitivo. Se emplearon dos técnicas avanzadas de espectrometría de masas
basadas en adquisición de datos independientes (data-independent acquisition, DIA):
SWATH-MS (Sequential Window Acquisition of All Theoretical Mass Spectra), que
permite la cuantificación reproducible de miles de péptidos, y diaPASEF (Parallel
Accumulation–Serial Fragmentation combinado con DIA), que ofrece mayor
sensibilidad y velocidad, especialmente útil en muestras con baja concentración de
proteínas. La integración de estos análisis proteómicos con el desarrollo de modelos
experimentales innovadores que simulan la migración temprana del parásito, también
realizados durante esta Tesis Doctoral, permitió alcanzar el objetivo principal de la
misma: identificar proteínas clave implicadas en el desarrollo temprano de F. hepatica en
el hospedador, con la intención de proponer nuevas dianas vacunales frente a la
fasciolosis.
Para investigar las adaptaciones moleculares de F. hepatica durante su desarrollo
temprano, se estableció un modelo in vivo en ratón de infección oral con las formas de
resistencia del parásito (metacercarias). Los parásitos juveniles se recuperaron en dos
etapas clave: a las 24 horas post-infección (p.i.) en la cavidad peritoneal, tras atravesar la
barrera intestinal, y a los 8 días p.i. en el parénquima hepático, reflejando el inicio de la
migración hepática. El perfil proteómico de las fracciones somática y tegumentaria del
parásito en estos estadios permitió una caracterización detallada de los cambios
dinámicos que experimenta el parásito al migrar en diferentes entornos del hospedador.
Los datos revelaron importantes modificaciones en las vías metabólicas, incluida la
transición progresiva desde la producción de energía aeróbica hacia mecanismos
anaeróbicos, así como la regulación de la maquinaria proteolítica, esencial para la
invasión tisular y la evasión del sistema inmunitario, reflejando las adaptaciones
fisiológicas que el parásito debe afrontar durante estas fases de la infección.
Así mismo, se desarrollaron sistemas de co-cultivo in vitro para estudiar las
primeras etapas de la migración a nivel celular en un entorno controlado de laboratorio.
Estos modelos fueron diseñados para replicar los ambientes que encuentra el parásito
durante la invasión del hospedador, con el objetivo de profundizar en la investigación de
las interacciones moleculares, y de reducir el uso de animales de experimentación. Los
primeros co-cultivos de los juveniles recién desenquistados de F. hepatica (FhNEJ) con
células murinas mesoteliales y estrelladas hepáticas, que representan respectivamente los
entornos peritoneal y hepático, mostraron una interacción limitada, ya que los datos
proteómicos tanto del parásito como de las células del hospedador revelaron pocos
cambios tras la interacción. Esto motivó el desarrollo de un modelo de co-cultivo
secuencial que simulase con mayor precisión la ruta natural de migración del parásito. En
este modelo, los co-cultivos de FhNEJ con células epiteliales intestinales y,
posteriormente, con células mesoteliales, revelaron adaptaciones proteómicas
diferenciadas. El contacto previo con el epitelio intestinal desencadenó una respuesta
específica y dependiente del tipo celular, ausente o atenuada en presencia de las células
mesoteliales, donde los cambios proteómicos fueron más limitados o enmascarados.
Los datos proteómicos obtenidos se integraron con información ómica
previamente publicada en modelos complementarios para identificar candidatos
vacunales en las etapas tempranas del desarrollo de F. hepatica. De este modo, las
proteínas catepsina B3 (FhCB3), legumina 1 (FhLeg1) y serpina 1 (FhSrp1) fueron
seleccionadas por su relevancia durante la migración inicial del parásito. El análisis in
silico predijo su inmunogenicidad y propiedades estructurales, mientras que los ensayos
de inmunofluorescencia confirmaron su localización en el tegumento del parásito. Para
profundizar en la relevancia funcional de estos antígenos, se desarrolló una innovadora
metodología de edición genética basada en CRISPR-Cas, que sienta las bases para futuros
ensayos orientados a evaluar el potencial vacunal de diversas dianas parasitarias a
travésde su estudio directo de su papel en la biología del parásito.
En definitiva, esta Tesis Doctoral aporta nuevos conocimientos sobre los
mecanismos moleculares implicados en el desarrollo temprano de F. hepatica y su
interacción con el hospedador. La integración de enfoques proteómicos, modelos
experimentales y análisis bioinformáticos permitió identificar antígenos clave con
potencial vacunal, abriendo nuevas vías para el control eficaz de la fasciolosis.
[EN] Fasciolosis is a parasitic disease caused primarily by the trematode Fasciola
hepatica. There is a growing global concern about this pathology, both in human and
animal health, as the parasite's ability to infect a wide variety of mammalian hosts, along
with its adaptability to diverse climatic conditions, has favored its expansion to new
regions, further driven by global warming and certain agricultural practices. Recognized
by the World Health Organization as a Neglected Tropical Disease, fasciolosis affects
approximately 17 million people, with more than 90 million at risk. It also causes
significant economic losses in the livestock industry, primarily sheep and cattle, estimated
at up to $3 billion annually, due to decreased productivity, mortality, and associated
treatment costs.
Treatment of fascioliasis continues to rely on the use of anthelmintic drugs.
However, the increasing emergence of resistance compromises their efficacy, making
vaccine development an urgent priority. Despite advances in our understanding of
F. hepatica biology, the initial stages of parasite migration within the vertebrate
(definitive) host—during which juvenile worms cross the intestinal barrier, move through
the peritoneal cavity, and enter the liver—have been relatively poorly explored at the
molecular level, despite representing key moments for the establishment of infection. In
this context, a thorough understanding of parasite-host interactions at these early stages
could lead to the identification of new vaccine candidates.
Currently, cutting-edge omics technologies are significantly expanding molecular
knowledge about F. hepatica, with proteomics being an essential link between its genome
and the parasite's biology. Within the framework of this PhD thesis, this approach has
been essential to identify the expression of parasite-specific proteins during the initial
stages of infection in the definitive host. Two advanced mass spectrometry techniques
based on data-independent acquisition (DIA) were employed: SWATH-MS (Sequential
Window Acquisition of All Theoretical Mass Spectra), which allows the reproducible
quantification of thousands of peptides, and diaPASEF (Parallel Accumulation–Serial
Fragmentation combined with DIA), which offers greater sensitivity and speed, especially
useful in samples with low protein concentrations. The integration of these proteomic
analyses with the development of innovative experimental models that simulate early
parasite migration, also conducted during this PhD thesis, allowed us to achieve the main
objective of this thesis: to identify key proteins involved in the early development of
F. hepatica in the host, with the aim of proposing new vaccine targets against fasciolosis.
To investigate the molecular adaptations of F. hepatica during its early
development, an in vivo mouse model of oral infection with resistant forms of the parasite
(metacercariae) was established. Juvenile parasites were recovered at two key stages: 24
hours post-infection (p.i.) in the peritoneal cavity, after crossing the intestinal barrier, and
8 days p.i. in the liver parenchyma, reflecting the onset of liver migration. Proteomic
profiling of the somatic and tegumentary fractions of the parasite at these stages allowed
a detailed characterization of the dynamic changes the parasite undergoes as it migrates
through different host environments. The data revealed significant modifications in
metabolic pathways, including the progressive transition from aerobic to anaerobic
energy production, as well as the regulation of the proteolytic machinery, essential for
tissue invasion and immune system evasion, reflecting the physiological adaptations the
parasite must undergo during these stages of infection.
In vitro co-culture systems were also developed to study the early stages of
migration at the cellular level in a controlled laboratory setting. These models were
designed to replicate the environments encountered by the parasite during host invasion,
with the aim of furthering the investigation of molecular interactions and reducing the use
of experimental animals. Initial co-cultures of newly excysted juvenile F. hepatica
(FhNEJ) with murine mesothelial or hepatic stellate cells, representing the peritoneal and
hepatic environments, respectively, showed limited interaction, as proteomic data from
both the parasite and host cells revealed few changes following interaction. This prompted
the development of a sequential co-culture model that more accurately simulated the
parasite's natural migration route. In this model, co-cultures of FhNEJ with intestinal
epithelial cells and, subsequently, with mesothelial cells revealed distinct proteomic
adaptations. Prior contact with the intestinal epithelium triggered a cell-type-specific
response, which was absent or attenuated in the presence of mesothelial cells, where
proteomic changes were more limited or masked.
The proteomic data obtained were integrated with previously published omics
information in complementary models to identify vaccine candidates in the early stages
of F. hepatica development. Thus, the proteins cathepsin B3 (FhCB3), legumin 1
(FhLeg1), and serpin 1 (FhSrp1) were selected for their relevance during the initial
migration of the parasite. In silico analysis predicted their immunogenicity and structural
properties, while immunofluorescence assays confirmed their localization in the parasite
tegument. To further investigate the functional relevance of these antigens, an innovative
CRISPR-Cas-based gene editing methodology was developed, which lays the
groundwork for future trials aimed at evaluating the vaccine potential of various parasitic
targets by directly studying their role in parasite biology.
Ultimately, this doctoral thesis provides new insights into the molecular
mechanisms involved in the early development of F. hepatica and its interaction with the
host. The integration of proteomic approaches, experimental models, and bioinformatics
analyses has allowed us to identify key antigens with vaccine potential, opening new
avenues for effective control of fascioliasis.
eng
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
info:eu-repo/semantics/openAccess
Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional
Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Fasciolosis
Fasciola hepatica
Resitencia antihelmíntica
Desarrollo de vacunas
Proteomic profiling of early migration stages of Fasciola hepatica in experimental models reveals key targets for fasciolosis vaccine development
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis