DBCP. Tesis del Departamento de Biología Celular y Patologíahttp://hdl.handle.net/10366/39652026-05-01T19:29:16Z2026-05-01T19:29:16ZEstudio del sistema nitrérgico y del equilibrio excitación/inhibición en el bulbo olfativo de un modelo experimental de autismo idiopáticoCabedo Navarro, Valeria Lorenahttp://hdl.handle.net/10366/1696262026-02-11T02:09:44Z2025-01-01T00:00:00Z[ES] La búsqueda de conocimiento sobre el autismo constituye un importante desafío para la comunidad científica y para la sociedad. A pesar del esfuerzo y de las numerosas investigaciones al respecto, todavía no están claras las características fisiopatológicas de este trastorno del neurodesarrollo. Así, aunque se ha avanzado en su comprensión, sigue habiendo numerosas cuestiones por resolver sobre su naturaleza precisa. Mediante la investigación básica se pretende arrojar luz sobre los intrincados mecanismos que subyacen al autismo, sobre sus bases moleculares, celulares, neuroanatómicas y conductuales.
En base a la evidencia científica disponible, se sabe que el desequilibrio entre la neurotransmisión excitatoria y la inhibitoria es clave en la patogenia del autismo. Al mismo tiempo, se ha propuesto una alteración en el sistema nitrérgico, agente modulador del equilibrio entre los tipos de actividad sináptica mencionados. En esta Tesis Doctoral se estudiaron los sistemas nitrérgico, GABAérgico y glutamatérgico en el bulbo olfativo del modelo murino de autismo inducido por ácido valproico (VPA). En primer lugar, se desarrolló un protocolo optimizado para obtener el ratón VPA, atendiendo a los procesos de inducción y de validación del modelo. En segundo lugar, se registraron déficits nitrérgicos en la región cerebral de interés. Finalmente, los análisis en torno a la excitabilidad sináptica revelaron una descompensación en la neurotransmisión por afectación de la vía glutamatérgica.
En el marco de las alteraciones neuronales inherentes al autismo, estos resultados ponen de manifiesto diversas desregulaciones en los sistemas de neurotransmisión/neuromodulación analizados y complejas dinámicas resultantes de su interrelación.
2025-01-01T00:00:00ZBúsqueda de biomarcadores pronósticos y terapéuticos en el carcinoma pulmonar de células escamosas. Correlación clínico-patológicaChinchilla Tábora, Luís Miguelhttp://hdl.handle.net/10366/1576992025-04-30T19:24:31Z2023-01-01T00:00:00Z[ES] Recientes investigaciones en el campo de la genética tumoral y en el estudio de nuevos biomarcadores oncológicos, ponen de manifiesto que el carcinoma pulmonar de células escamosas (CPCE) es una neoplasia biológicamente muy heterogénea en cuanto a sus características moleculares, respuesta terapéutica y pronóstico de los pacientes.
Se ha acumulado una gran cantidad de información sobre los biomarcadores predictivos en el carcinoma pulmonar de célula no pequeña (CPCNP). La mayoría de ellos se han identificado en el subtipo histológico de adenocarcinoma (ADC). En este sentido, las alteraciones a nivel del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y los reordenamientos de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK) merecen especial atención por su significado terapéutico. Se estima que uno de cada tres pacientes con histología ADC se benefician de este tipo de tratamientos, evitando recaídas precoces y mejorando la supervivencia global del paciente. Sin embargo, la aplicación de terapias moleculares dirigidas al CPCE en el entorno clínico es muy limitado, convirtiéndose en una de las principales áreas de enfoque en la investigación. Para este subtipo histológico, la inmunoterapia genera en la actualidad una nueva esperanza y se está aplicado con éxito en algunos pacientes. Aunque los pacientes con terapia de PCI pueden lograr una supervivencia global (SG) a largo plazo, los mecanismos subyacentes a la resistencia y/o sensibilidad frente al bloqueo PD-L1/PD-1 actualmente no se conocen bien, existiendo la necesidad inminente de identificar nuevos biomarcadores capaces de predecir con precisión la respuesta a la inmunoterapia en este tipo de pacientes. El perfil de expresión génica (GEP), es una herramienta interesante para la identificación de nuevos marcadores genéticos, que permite el estudio de varios miles de genes específicos de forma simultánea. En el caso concreto del cáncer de mama, las herramientas basadas en análisis de GEP como PAM50® (Prosigna; NanoString Technologies, Seattle, WA) y Oncotype DX® (RS; Genomic Health, Redwood City, CA), se han establecido de forma rutinaria en la práctica clínica y resultan fundamentales como predictores de recaídas tempranas, posicionándose como una importante herramienta para identificar biomarcadores asociados al pronóstico y tratamiento de pacientes con diferentes tipos de neoplasias, incluido el CPCE. La identificación de estas moléculas permitirá un protocolo más rápido, barato y preciso en la toma de decisiones para un tratamiento personalizado del CPCE. Ante estos antecedentes, en el presente trabajo doctoral nos hemos planteado los siguientes objetivos:
1. Profundizar en el conocimiento de la heterogeneidad genética/genómica del carcinoma pulmonar de células escamosas (CPCE) a nivel intratumoral, buscando identificar aquellas alteraciones implicadas en pronóstico y/o en la respuesta al tratamiento mediante la identificación de los diferentes clones de células tumorales presentes en el tumor con técnicas de FISH multicolor, análisis del número de copias de secuencias de DNA (CVN) y perfiles de expresión mediante arrays de alta densidad.
2. Identificar las alteraciones cromosómicas más frecuentes y los patrones de evolución clonal a nivel intratumoral en el CPCE, así como la posible correlación con las características clínico-biológicas e histopatológicas de la enfermedad con influencia significativa en la SG de una serie larga de pacientes.
3. Analizar el perfil de la expresión diferencial de genes involucrados en la compleja interacción entre el tumor, el microambiente y la respuesta inmunitaria en pacientes con CPCE, lo que podría permitir conocer los mecanismos de evasión inmunitaria. 4. Establecer las posibles asociaciones existentes entre las alteraciones individuales de cada cromosoma y gen estudiado y los patrones de expresión encontrados, con el comportamiento clínico-biológico de la enfermedad y respuesta al tratamiento, con especial énfasis en la identificación de la expresión anómala de genes que nos permitan pre
deccir la respuesta al tratamiento en pacientes CPCE que hayan recibido inmunoterapia.
5. Diseñar un algoritmo genómico que nos permita predecir la respuesta a la terapia anti-PD-L1 en el momento del diagnóstico y validarlo en una serie independiente de pacientes con CPCE tratados con inmunoterapia.
2023-01-01T00:00:00ZFactores neurotróficos y su efecto neuroprotector en un modelo murino de degeneración neuronal selectivaPérez Revuelta, Laurahttp://hdl.handle.net/10366/1532572025-04-30T19:24:32Z2023-01-01T00:00:00Z[ES]Las enfermedades neurodegenerativas son patologías del SNC o periférico que se caracterizan por la pérdida progresiva de elementos neurales. La búsqueda de nuevas terapias que puedan frenar o paliar el proceso de muerte celular que acompaña a estas enfermedades es un desafío que la comunidad científica ha afrontado en las últimas décadas. A pesar de que en la actualidad existen medicamentos que alivian los síntomas, todavía no se ha encontrado un tratamiento que sea realmente eficaz para detener o frenar la progresión de estas graves afecciones. Cada vez hay más estudios que proponen las terapias con factores neurotróficos como las más prometedoras para conseguir tal deseada paliación, por su papel en el desarrollo, diferenciación, proliferación y supervivencia de las células nerviosas. En este sentido, la investigación con modelos animales de enfermedades neurodegenerativas juega un papel fundamental en el diseño de nuevos tratamientos y la evaluación de su eficacia en estudios preclínicos. En la presente Tesis Doctoral usaremos el ratón PCD, modelo directo de la patología humana CONDCA que, además de presentar una gran utilidad para estudiar diferentes procesos de degeneración neuronal selectiva, sirve para evaluar diferentes tratamientos farmacológicos. La degeneración rápida y selectiva de las células de Purkinje del cerebelo de este ratón permite estudiar cómo el deterioro progresivo puede afectar al comportamiento motor, cognitivo y social, y cómo podemos, en su caso, evitar esta disfunción tras un tratamiento farmacológico. Por lo tanto, la hipótesis de la presente Tesis Doctoral es que el tratamiento con factores neurotróficos tiene efectos neuroprotectores en el modelo PCD de degeneración neuronal selectiva.
2023-01-01T00:00:00ZTerapia celular combinada con el fármaco neuroprotector N-Oleiletanolamina en un modelo murino de degeneración neuronal selectivaPérez Martín, Esterhttp://hdl.handle.net/10366/1508182023-06-13T10:48:11Z2022-01-01T00:00:00Z[ES] Desde hace décadas, la búsqueda y el desarrollo de tratamientos eficaces para hacer
frente a la pérdida neuronal de las enfermedades neurodegenerativas han supuesto un gran
desafío para la ciencia y la sociedad. La mayoría de las terapias actuales son paliativas y
están basadas en la filosofía “un gen, una enfermedad, un fármaco”. Sin embargo, existen
pocos estudios en los que se haya explorado el efecto sinérgico resultante de la
combinación de diferentes estrategias terapéuticas para impedir esta degeneración neuronal.
Esta Tesis Doctoral analiza y compara las propiedades neuroprotectoras a nivel celular
y comportamental de tratamientos combinados de una terapia farmacológica con Noleiletanolamina
(OEA) y de terapia celular con células madre, en un modelo de
degeneración neuronal cerebelosa: el ratón mutante PCD. En primer lugar, el tratamiento
exclusivo con OEA retrasa las alteraciones morfológicas y la muerte de las neuronas en
degeneración, modula la neuroinflamación y restaura funciones motoras, cognitivas y
sociales alteradas en este modelo animal. En segundo lugar, los tratamientos combinados
evaluados no muestran de forma global una neuroprotección sinérgica respecto al
tratamiento farmacológico exclusivo con OEA, salvo en el comportamiento motor.
Estos resultados ponen en evidencia la complejidad de la patología neurodegenerativa
y de sus posibles tratamientos. Lejos de apoyar el enfoque empírico como solución a largo
plazo, estos resultados invitan a una investigación más consolidada de los mecanismos
subyacentes a estos fenómenos biológicos.
[EN] For decades, the search and development of effective treatments to stop the defining
neuronal loss of neurodegenerative diseases have posed a great challenge for science and society.
Most of the current therapies are palliative and based on the “one gene, one disease, one drug” philosophy. However, few studies addressed the synergistic effect driven by the combination of
different therapeutic strategies to prevent this neuronal degeneration.
In this Doctoral Thesis, the neuroprotective properties of combined treatments of a
pharmacological therapy with oleoylethanolamide (OEA) and stem cell therapy are analyzed and
compared at the cellular and behavioral levels in a model of cerebellar neuronal degeneration: the
PCD mutant mouse. First, exclusive treatment with OEA delays morphological alterations and
death of degenerating neurons, modulates neuroinflammation, and restores impaired motor,
cognitive, and social functions in this animal model. Secondly, the combined treatments assessed
do not fully exert a synergistic neuroprotection with respect to the exclusive pharmacological
treatment of OEA, except for motor behavior.
These findings highlight the complexity of neurodegenerative pathology and its potential
treatments. Far from supporting the empirical approach as a long-term solution, these results call
for more consolidated research of the mechanisms underlying these biological phenomena.
2022-01-01T00:00:00ZEl lóbulo X del cerebelo: análisis génico y molecular de su resistencia a la degeneración neuronal del ratón PCDHernández Pérez, Carloshttp://hdl.handle.net/10366/1507792025-10-16T00:04:52Z2022-01-01T00:00:00Z[ES] El ratón PCD es un modelo genético que sufre ataxia cerebelosa debido a la muerte de
las células de Purkinje. Sin embargo, el lóbulo X del cerebelo de este animal resiste dicha
degeneración neuronal más tiempo que el resto de los lóbulos. Es llamativo, además, que esta
resistencia en el cerebelo sea constante en etiologías distintas de ataxia, e incluso en especies
diferentes. Ello podría implicar que los mecanismos que subyacen a esta resistencia podrían ser
aplicables para otras enfermedades neurodegenerativas, diferentes a las ataxias
espinocerebelosas.
En el ratón PCD, la muerte de las células de Purkinje en el cerebelo es evidente a partir
de P20 y, aunque no es tan severa, también existe muerte de las células mitrales del bulbo
olfativo a partir de P70. Por otro lado, estudios previos del laboratorio han demostrado en
ratones silvestres que existe un fuerte pico de expresión de Ccp1 en el cerebelo a P15-P20 y una
expresión mínima en el bulbo olfativo a P60-P80. La expresión de Ccp1 en controles coincide en
intensidad y en tiempo con la degeneración neuronal que sufre el ratón PCD. Parece pues que
en el ratón silvestre, el nivel de expresión de Ccp1 en un tejido o en una región encefálica es
determinante para alcanzar la homeostasis de estos: a mayor expresión de Ccp1, mayor parece
la dependencia para alcanzar la homeostasis en caso de falta de Ccp1. Por ello, es posible que
parte de la menor vulnerabilidad del lóbulo X a la degeneración neuronal en el ratón PCD sea
debida a una menor dependencia a la expresión de Ccp1.
Por otro lado, se ha comprobado que la falta de Ccp1 en otros tejidos del encéfalo no es
tan dañina como en el cerebelo, esto es debido a que existe una mayor expresión de otras
proteínas de la misma familia de Ccp1, como Ccp6. De hecho, una inhibición simultánea de la
expresión de Ccp1 y Ccp6 causa daños más generalizados en todo el encéfalo que los que sufre
el ratón PCD. Por otro lado, existen experimentos que demuestran que el déficit de TTLL1, la
proteína con la función inversa a la de CCP1, anula los efectos neurodegenerativos de la
mutación pcd.
Por último, se ha comprobado en otros modelos animales que HSP25 es una proteína
con demostrados efectos neuroprotectores en el lóbulo X del cerebelo. Además de su actividad
como chaperona, su estado de fosforilación también parece ser clave a la hora de detener los
procesos apoptóticos. De hecho, estudios previos han mostrado el efecto neuroprotector de
HSP25-P y de la quinasa que la produce, PKC-δ.
Por lo tanto, la hipótesis de la presente Tesis Doctoral es que “el lóbulo X del cerebelo
es menos vulnerable a la mutación pcd y, además, presenta un fenotipo celular neuroprotector;
por ello es una región resistente a la degeneración neuronal”.
En función a la hipótesis planteada se desglosarán los siguientes objetivos generales y
específicos:
1. Analizar los patrones normales de expresión de Ccp1 en el lóbulo X y el resto de los
lóbulos cerebelosos.
a. Estudiar la expresión génica de Ccp1 en animales sin la mutación para conocer
su patrón normal.
2. Analizar los patrones de expresión normales y patológicos de Ccp4, Ccp6 y Ttll1 en el
lóbulo X y el resto de los lóbulos cerebelosos.
a. Comprobar la expresión génica de Ccp4, Ccp6 y Ttll1 en ratones control y PCD
para conocer su expresión normal y patológica.
b. Examinar CCP1, CCP4, CCP6 y TTLL1 a nivel proteico en el mismo tejido.
3. Analizar la expresión de factores neuroprotectores en el lóbulo X de los ratones PCD.
a. Conocer la expresión de HSP25 en el lóbulo X de ratones silvestres y PCD.
b. Examinar la expresión de HSP25-P en el lóbulo X de ratones silvestres y PCD.
c. Analizar la expresión de PKC-δ en el lóbulo X de ratones silvestres y PCD.
2022-01-01T00:00:00ZAlteración del sistema inmunitario periférico en un modelo murino de neurodegeneración selectiva: base para terapias con células madre con potencial inmunomoduladorPilar Rodríguez, Carlos delhttp://hdl.handle.net/10366/1453032023-06-13T13:08:33Z2020-01-01T00:00:00Z[ES] Cada vez es más evidente la interrelación que existe entre los sistemas inmunitario y nervioso, así como su implicación en la fisiopatología de las enfermedades neurodegenerativas. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral ponen de manifiesto esta comunicación en un modelo murino de ataxia cerebelosa: el ratón PCD. En particular, la degeneración selectiva de las células de Purkinje induce un efecto atrayente específico sobre los leucocitos en el cerebelo. Asimismo, las células mieloides de este modelo animal presentan alteraciones fenotípicas que pueden servir como biomarcador temprano de la neurodegeneración cerebelosa.
Por otro lado, en el presente trabajo se explica la posibilidad de tratar la neurodegeneración mediante el empleo de células madre derivadas de la médula ósea, como las células madre mesenquimales humanas y las células mieloides inmaduras. En concreto, el trasplante con células mieloides inmaduras en el cerebelo de los ratones PCD, aunque no reduce la muerte de las células de Purkinje, resulta eficaz a la hora de evitar los daños asociados a una cirugía estereotáctica.
2020-01-01T00:00:00ZAnálisis funcional de PP2AB55 en ciclo celular, autofagia y transcripciónVázquez Bolado, Alicia Uxíahttp://hdl.handle.net/10366/1452122025-04-30T19:24:34Z2020-07-01T00:00:00Z[ES] Los objetivos de este estudio son:
1. Estudiar el papel de la ruta Greatwall-Endosulfina-PP2AB55 en el control del ciclo celular y la entrada en quiescencia.
Objetivos específicos:
2. Estudiar el papel de la ruta Greatwall-Endosulfina-PP2AB55 en la transición G2/M.
3. Caracterizar el papel de la ruta Greatwall-Endosulfina-PP2AB55 en la entrada en quiescencia:
a) Discernir su implicación en autofagia.
b) Analizar su papel en la implementación del programa transcripcional en ausencia de nitrógeno.
2020-07-01T00:00:00ZResumen de tesis. Desubiquitinasas moduladoras de receptores TrkMartín Rodríguez, Carloshttp://hdl.handle.net/10366/1408492023-06-13T12:56:49Z2019-01-01T00:00:00Z[ES] Partiendo de un ensayo de identificación de posibles desubiquitinasas implicadas en la señalización del receptor TrkA, seleccionamos ocho para realizar estudios adicionales. De estas ocho, elegimos dos para estudiar en profundidad su papel en la ubiquitinación de los receptores TrkA y TrkB.
2019-01-01T00:00:00ZAnálisis del potencial de las alteraciones estructurales y metabólicas de las células de Müller como responsables de los eventos conducentes a la degeneración retiniana en el modelo animal de retinosis pigmentaria Crb1rd8Valle Álvarez, Vicentehttp://hdl.handle.net/10366/1405302025-06-05T12:40:28Z2019-09-01T00:00:00Z[ES] En la literatura relacionada con los complejos de polaridad celular en modelos animales se ha descrito que, en la retina del ratón, la proteína CRB1 se expresa únicamente (o mayoritariamente) en las células de Müller (van Rossum et al., 2006). En el modelo de degeneración de retina Crb1rd8, la mutación en el gen Crb1 provoca la desestructuración de la membrana limitante externa, produciéndose una pérdida de polaridad celular y condicionando la viabilidad de las células fotorreceptoras, reflejándose en la aparición de rosetas especialmente concentradas en el cuadrante inferior de la retina. Si bien la bibliografía actual sobre este modelo describe que las primeras alteraciones en este modelo se producen en el estadio P14 (Mehalow et al., 2003), estudios previos realizados en nuestro laboratorio mediante análisis a microscopía electrónica evidenciaron que ya en la primera semana de vida, concretamente en el estadio postnatal P7, se producía una pérdida puntual de las uniones adherentes entre fotorreceptores y células de Müller en las retinas del ratón Crb1rd8 (Herranz-Martín, 2013).
A pesar de que las células de Müller expresan la proteína CRB1, las descripciones relacionadas con este tipo celular han estado restringidas a los mecanismos de gliosis que pueden experimentar ante los mecanismos degenerativos en el modelo Crb1rd8. Sin embargo, no se han estudiado las alteraciones que pudieran producirse en proteínas relacionadas con los procesos homeostáticos de la retina en los que están involucradoas las células de Müller, ni las posibles alteraciones que esta mutación puede provocar sobre otros tipos celulares, tanto neurales como microgliales, durante el inicio y la progresión de la degeneración.
Dado el predominio en el número de células de Müller frente a otros elementos gliales retinianos y su función tanto en la citoarquitectura de la retina como en el control y papel fundamental en los mecanismos homeostáticos de la retina, nos planteamos la hipótesis de que la mutación en el gen Crb1 induce alteraciones tanto estructurales como funcionales en algunas de las proteínas esenciales para el correcto desempeño de las células de Müller, que en consecuencia afecta al normal funcionamiento de otros tipos celulares de la retina y que en definitiva podrían iniciar y/o acelerar los mecanismos degenerativos de la retina en el modelo experimental de Retinosis Pigmentaria, Crb1rd8.
Para comprobar esta hipótesis nos planteamos los siguientes objetivos:
1) Analizar el estado de la retina del modelo Crb1rd8 en el estadio temprano P7, mediante el análisis de componentes de los complejos de polaridad y su desarrollo angiogénico.
2) Caracterizar el estado de las células de Müller mediante el análisis de la distribución y expresión de transportadores de membrana plasmática que son esenciales para su función, así como de proteínas involucradas en determinadas rutas de señalización.
3) Analizar el estado de la población de células microgliales durante el desarrollo de la degeneración en la retina del modelo Crb1rd8 para investigar la influencia que la mutación en la proteína CRB1 puede provocar sobre este tipo celular.
4) Analizar el estado de los elementos neurales, así como de sus sinapsis, en las retinas afectadas por la mutación en CRB1.
5) Estudiar en cultivos primarios la expresión de proteínas relacionadas con diversas funciones de las células de Müller, así como el estado de las uniones que se establecen entre ellas, para poder dilucidar si las alteraciones observadas en las células de Müller in vivo se deben a la mutación intrínseca del gen Crb1 en las propias células, o es necesaria la influencia del entorno y los contactos/funciones celulares que se establecen en las retinas in vivo.
2019-09-01T00:00:00ZAnsiedad y depresión en los adolescentes brasileños de enseñanza media: comparación con la población españolaMelo, Heloisa Maria Pereira dehttp://hdl.handle.net/10366/1403322025-10-17T00:06:53Z2019-01-01T00:00:00Z[ES] El objetivo de estudio ha sido investigar el índice de ansiedad y depresión en adolescentes de educación secundaria, en las ciudades de Recife (Brasil) y de Salamanca (España). Se pretenden resaltar las diferencias asociadas con el sexo, la edad, el nivel socioeconómico, la comorbilidad y el país. El interés del tema radica en que actualmente se han detectado en los adolescentes y jóvenes un incremento de problemas psicológicos, los asociados con las emociones, tales como el estrés o la ansiedad, o vitales, tales como el acoso escolar, la violencia, el uso de drogas, o incluso los suicidios.
La selección de la muestra del estudio se ha realizado a través de un muestreo no probabilístico incidental, en el que participaron 447 estudiantes de escuelas públicas secundarias de edades comprendidas entre los 13 y los 18 años en Recife, Brasil y Salamanca, España. Se han utilizado tres cuestionarios como instrumentos de evaluación; El Inventario de Depresión Infantil (CDI) por Kovacs (1992); El Inventario de Ansiedad del Estado-Rasgo (STAI) por Spielberger, Gorsuch y Lushene, (2002) y un cuestionario socioeconómico basado en el estudio de clase social (Hollingshead y Redlich, 1958). La investigación se ha diseñado utilizando un estudio descriptivo, transversal, comparativo y cuantitativo. Los resultados han confirmado la hipótesis de que el sexo está relacionado con el nivel de ansiedad y depresión de los adolescentes e indica que la ansiedad y la depresión han sido más significativas en las adolescentes chicas que en los adolescentes varones. Además, el estudio señala que la edad también está relacionada con el índice de ansiedad y depresión en adolescentes.
Estadísticamente, no se han encontrado diferencias significativas en esta investigación, con respecto a los niveles socioeconómicos de los adolescentes en ambos países. En cuanto al factor de comorbilidad entre la ansiedad y la depresión en los adolescentes, los resultados enfatizan que existe un índice significativo, especialmente en las adolescentes del sexo femenino. Además, los resultados no destacaron la variable del país como un factor relevante, aunque Brasil, destaca más prevalencia en el índice de ansiedad y depresión que España.
Palabras clave: anxiety, depression, adolescents, Brazil, Spain.
2019-01-01T00:00:00ZLa córnea en la enfermedad injerto contra huésped: patolagía y tratamiento con células mesenquimales estromales humanasMartínez-Carrasco Pérez, Rafaelhttp://hdl.handle.net/10366/1373472025-06-05T12:40:28Z2017-01-01T00:00:00Z[EN]Graft versus host disease (GVHD) is a common complication of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), an established and potentially curative treatment for malignant and benign hematological disorders. As a part of this treatment, lymphocytes are introduced within an immunocompromised host, where they are able to recognize host antigens as foreign. This recognition has a beneficial effect, termed graft versus leukemia (GVL), which allows destruction of malignant cells and reduces the probability of relapse. However, the morbidity and mortality caused by GVHD limits the use of this treatment in a wide number of disorders. Separation of GVL and GVHD has been tried without success, given that the same immune mechanism is involved in both cases.
Ocular involvement is present in 60-90 % of GVHD patients. This ocular GVHD (oGVHD) affects the ocular surface and lacrimal glands, as well as the Meibomian glands, leading to tear film instability. Hence, corneal tissues are exposed to stressful conditions that lead to the loss of the characteristic immune privilege of this part of the eye. The most frequent complication in oGVHD is dry eye, a multifactorial disease characterized by hyperosmolarity of the tear film and inflammation, with damage to the ocular surface. The consequences include the disruption of epithelial barrier, irritation and impaired vision. Although problems derived from oGVHD do not often include loss of vision, they are one of the main causes of deterioration of quality of life.
As the treatment of oGVHD is palliative, usually based in tear substitutes, it is necessary to explore new treatments to improve the prognostic of this debilitating disease. Suppression of immune response has shown some good results, but medications like tacrolimus are not recommended for long-term use and some patients just do not respond to treatment. Mesenchymal stromal cells (MSC) are being used in medical trials as reparative treatment, given their ability to limit tissue destruction and enhance repair in various diseases. MSC, which were first described as resident cells in the bone marrow, have a great differentiation potential. In the last years, their immune-modulatory effects have received special attention and they are being used in a number of immune-mediated diseases with promising results.
The goal of this thesis is to advance in the knowledge of GVHD events in the eye and explore the therapeutic potential of MSC in corneal damage caused by oGVHD, using a well stablished murine model of the disease.
Material and methods
Bone marrow and splenic cells from C57BL/6J mice (H2b) were used to induce GVHD in BALB/c mice (H2d) that received total body irradiation (TBI) as conditioning regimen (GVHD mice). No manipulated mice (Control mice) or mice that received only bone marrow cells after TBI (BM mice) served as controls. A group of mice with GVHD were treated with human MSC (hMSC) at day 10 post-transplantation by subconjunctival injection in the right eye (GVHD+MSC eyes).
Systemic GVHD and oGVHD were monitored weekly, using previously stablished scoring systems. Tear condition was evaluated through tear osmolarity and tear volume assessment. Finally, we analyzed corneal damage and inflammation using immunofluorescence in sections and qPCR techniques. Transcription factor Pax6 and the corneal envelope protein SPRR1B where analyzed as markers of squamous metaplasia. Inflammation was studied through detection in the cornea of CD3, a marker of T lymphocytes, and expression of TNF-α and IL-1β.
Gene expression of MMP9 was also analyzed in mice corneas, as this protease is involved in epithelial barrier disruption. In addition, we performed experiments with a human corneal-limbal epithelial (HCLE) cell line. These cells were exposed to TNF-α and IL-1β for 48 h and the effect in MMP9 levels were analyzed by PCR and gel zymography. PAX6 expression was also evaluated in these cells.
Finally, we explored the possibility that MSC were able to engraft in the cornea. For this purpose, hMSC were transfected with a lentiviral vector to express green fluorescent protein (GFP). Hence, the presence of hMSC in corneal tissue was analyzed by immunofluorescence with antibodies against GFP and human mitochondria. In addition, we performed PCR to detect the possible expression of human GAPDH, which would demonstrate the presence of hMSC in the cornea.
Results and discussion
In the present work we have validated the use of the TearLab osmolarity System in mice. Readings with this system were similar to those obtained with other methods and we obtained good values for intraclass correlation coefficient (ICC), suggesting a good reliability of the procedure.
Two forms of GVHD were noticed, because of the use of two different doses of splenic cells to induce the disease. Mice transplanted with 5 x 106 splenocytes (5M) developed a more severe GVHD, where the treatment with MSC had no visible effect. Among the corneal alterations caused by the GVHD, thinning of the epithelium and loss of Pax6 was common. In the most serious cases, total loss of Pax6 in epithelial cells and epithelial thickening was observed, a characteristic of the pathological process of squamous metaplasia. Furthermore, we saw evidence of severe inflammation, with T cell invasion in almost all corneas analyzed.
Transplantation with 4 x 106 splenocytes (4M) resulted in a milder form of GVHD. These mice showed an improvement when they were treated with MSC as reflected by a better evolution of the ocular disease score. Tear osmolarity was increased and tear volume was decreased in GVHD mice compared with BM mice. These are evidences that a process of ocular dryness takes place in this model of GVHD. In contrast, BM and GVHD+MSC eyes showed similar values in both parameters.
A thinner epithelium was also observed in 4M mice, which was not affected by the treatment with MSC. However, detection of Pax6 in corneal epithelium showed a similar pattern in GVHD and Control mice, and its gene expression was enhanced in GVHD corneas. In contrast, Pax6 was reduced in GVHD+MSC corneal sections and a non-statistically significant decrease was observed in gene expression. As Pax6 loss has been proposed as a marker for squamous metaplasia, we analyzed SPRR1B to know if keratinization was occurring. Our results showed an increase in SPRR1B staining in GVHD eyes that was lower in GVHD+MSC mice, which demonstrate that corneal keratinization is less frequent after treatment with hMSC. These results indicate, also, that variations in the expression of Pax6 do not always correlate with the appearance of keratinizing proteins.
Immune cell invasion also occurred in 4M mice, as shown by the presence of CD3+ cells in the cornea of GVHD mice. Interestingly, no GVHD+MSC cornea presented CD3+ cells. Gene expression of IL-1β was augmented in some non-treated eyes but not in any treated one. TNF-α expression was highly increased in all corneas but in Control and GVHD+MSC. These results demonstrate that hMSC exerted an anti-inflammatory effect in the cornea of mice with GVHD.
As TNF-α was increased also in MO mice, we used animals that only received the TBI to know if irradiation was underlying this effect. Our results confirmed this, as well as the effect of irradiation on Pax6 expression, which was also increased in these TBI mice.
The presence of hMSC in the cornea of treated mice was determined by the immunodetection with antibodies against GFP and human mitochondria. Only two 5M animals, strongly affected by the disease exhibited positive staining for both markers. No staining was found in 4M mice neither by immunofluorescence nor by PCR detection of the transcript for human GAPDH. Therefore, MSC do not migrate to the cornea and the observed effects might be brought about by an action at distance.
Given the important role of MMP9 in epithelial barrier disruption, we analyzed its expression in the cornea of our animals. We found a decrease in MMP9 expression in MO and GVHD corneas, compared to Control group, but not in GVHD+MSC corneas. Since our results were contrary to what was observed in previous studies, we also performed experiments with HCLE cells, to know if the exposure to inflammatory cytokines could explain the decrease in MMP9 expression. These cells were exposed to TNF-α and IL-1β for 48 h and the effect in MMP9 levels were analyzed by PCR and gel zymography. The results point to a complex regulation of the expression of MMP9, given that the presence of IL-1β results in a decrease in gene expression but an increase in extracellular active MMP9.
In summary, we found that the use of MSC could be an effective treatment in oGVHD, as some of its more relevant consequences were reverted or avoided. MSC-treated mice showed better results in tear film measurements, and they had fewer keratinization features. More importantly, inflammation was reduced, decreasing the expression of TNF-α and avoiding T-cell infiltration. However, the treatment had no effect in a more severe form of GVHD, generated with a higher dose of splenic cells. The observed effects were not attributable to migration of MSC to corneal tissue.
2017-01-01T00:00:00ZCaracterización de los oligodendrocitos en la vía visual del pez cebra en desarrollo y en procesos regenerativosLeón-Lobera, Fernandohttp://hdl.handle.net/10366/1370772025-06-05T12:40:28Z2017-01-01T00:00:00Z[ES] El sistema visual de los peces constituye un modelo muy útil para el estudio de distintas patologías del Sistema Nervioso Central (SNC). Su capacidad de regeneración espontánea tras una lesión, junto al fácil acceso y manipulación del Nervio Óptico (NO), lo convierten en un sistema ampliamente usado en la bibliografía. Además, la retina de estos animales aumenta su tamaño durante toda la vida adulta, generando nuevos axones que han de ser mielinzados. Los oligodendrocitos son las células mielinizantes del sistema nervioso central. A pesar del amplio conocimiento que existe de estas células durante el desarrollo embrionario en peces, poco se sabe de su papel durante los procesos de crecimiento continuado y regeneración. En la presente tesis doctoral nos planteamos caracterizar inmunohistoquímicamente y analizar la respuesta durante el pinzamiento de los oligodendrocitos de la Cabeza de Nervio Óptico (CNO) y el NO. También analizamos la respuesta de distintos genes del linaje oligodendroglial, incluida la glutamina sintetasa (GS). Finalmente, observamos el posible origen y desarrollo de los oligodendrocitos del sistema visual de un teleósteo, el pez cebra. El pequeño tamaño, facilidad de cría y manipulación genética del pez cebra lo han convertido en los últimos años en un modelo animal muy empleado en el estudio del SNC.
Empleamos por lo tanto peces cebra (Danio rerio) adultos y durante el desarrollo (como larvas en distintos estadios) de animales silvestres AB y transgénicos. Algunos de los ejemplares adultos fueron sometidos a un pinzamiento de su NO derecho, y fueron sacrificados a distintos tiempos durante el desarrollo.
Nuestros resultados demuestran que los oligodendrocitos de la vía visual se caracterizan como células GS+, no colocalizando este marcaje con el de los astrocitos reticulares. Además, estos astrocitos se caracterizaron como células pax2/sox2, constituyendo una población de progenitores hasta ahora sin describir en el sistema visual de peces. Tras el pinzamiento, los oligodendrocitos y los astrocitos aumentaron sus recuentos en el sistema visual, no detectando cambios a los 60 días tras la lesión. Los distintos genes estudiados mostraron una disminución en la retina, mientras que experimentaron un aumento en el NO durante el proceso regenerativo. Además, mostramos como uno de los parálogos de la GS, glulc, parece estar especialmente implicado en este proceso en el NO. Finalmente, creemos que existe una población residente de células progenitoras de oligodendrocitos (OPCs) en el sistema visual del pez cebra, y que podría estar implicada en la generación de nuevos oligodendrocitos tras el pinzamiento.
Por otra parte, mostramos cómo los oligodendrocitos de la vía visual parecen proceder de áreas cefálicas (áreas preópticas) similares a las observadas en otros vertebrados. Estos oligodendrocitos comienzan la mielinización a los 5dpf, antes de lo descrito en la bibliografía. Además, detectamos ya desde estos momentos no sólo las posibles OPCs que se mantendrían en los animales adultos sino además los astrocitos reticulares pax2/sox2.
Nuestros resultados por lo tanto demuestran la validez del pez cebra y de su sistema visual como una herramienta robusta en el estudio de las distintas poblaciones gliales del SNC y de sus alteraciones en distintas patologías.
2017-01-01T00:00:00ZPapel de la proteína CRB2 durante la polarización, diferenciación y madurez del apitelio pigmentario de la retinaEscudero Paniagua, Antoniohttp://hdl.handle.net/10366/1329222025-06-05T12:40:28Z2016-01-01T00:00:00Z[ES] 1. El cultivo de células ChRPE desarrollado en el presente trabajo constituye un excelente modelo para el estudio de la biología de las células epiteliales en general, y del epitelio pigmentario en concreto, ya que, además de ser de fácil adquisición y cultivo, estas células muestran características propias de un epitelio altamente polarizado y diferenciado.
2. El anticuerpo dirigido contra CRB2 desarrollado en el presente trabajo es una herramienta válida para el estudio de la proteína CRB2, tanto humana como murina, y representa, hasta el momento, el único anticuerpo capaz de reconocer específicamente a esta proteína tanto por técnicas de inmunofluorescencia como por Western blot.
3. La proteína CRB2 es, hasta el momento, la única isoforma CRB detectada en el epitelio pigmentario. En este tejido completa el establecimiento del complejo Crb en las uniones ocluyentes durante el proceso de polarización apicobasal, desde donde regula la diferenciación de este tipo celular mediante la estabilización de estas uniones y del complejo Crb en la membrana plasmática, y mediante la promoción de su salida del ciclo celular.
4. CRB2 es esencial para el mantenimiento de la homeostasis de las células de epitelio pigmentario in vivo, ya que su falta provoca defectos en la organización morfológica y molecular de estas células, que conllevan un reclutamiento masivo de células microgliales y su activación en el espacio subretinal, y que podría ser determinante para el correcto funcionamiento de la retina.
5. CRB2 es una proteína clave para el desarrollo del fenotipo epitelial, caracterizado por su polarización apicobasal y diferenciación. Su falta en la célula ya madura produce cambios esenciales en ambas características por lo que resulta fundamental para el desarrollo de las funciones del epitelio. Por lo tanto, defectos en las funciones de CRB2 pueden ser desencadenantes de patologías de origen epitelial, como son diferentes tipos de tumores o, en el ojo, la degeneración macular asociada a la edad.
2016-01-01T00:00:00ZVariaciones morfológicas en el testículo de Ratones Adultos Knock Out para la proteína de sustrato de receptor insulínico IRS2Paz Rodríguez, José Ignaciohttp://hdl.handle.net/10366/1285012025-06-05T12:40:28Z2016-01-01T00:00:00Z[ES] Después de analizar los efectos que la ausencia de la proteína de sustrato de receptor insulínico IRS2 ejerce sobre la morfología de los túbulos seminíferos en ratones knock out para IRS2 de 6 y 12 semanas y compararlos con las características morfológicas de los ratones wild type, mediante un estudio histológico/histopatológico con hematoxilina eosina y su posterior análisis morfométrico; valorando las alteraciones en la proliferación celular empelando PCNA como marcador de proliferación y detectar la aparición de apoptosis mediante el marcaje inmunocitoquímico con caspasa 3 activa; contrastado los resultados obtenidos con la literatura existente, hemos llegado a las siguientes conclusiones:
1.- Este es el primer estudio que asocia el análisis histoquímico-morfométrico con las variaciones en proliferación y apoptosis en ratones adultos que carecen de la proteína IRS2. Dada la relevan-cia clínica que tiene la diabetes tipo 2 y puesto que este modelo animal desarrolla una resistencia periférica a la insulina acompa-ñada de diabetes tipo 2, los resultados obtenidos tienen gran re-levancia puesto que ofrecen alteraciones testiculares no ligadas a la hiperglucemia. Alcanzando los objetivos propuestos al inicio del estudio.
2.- Los resultados obtenidos sugieren que la ausencia de IRS2 induce la aparición de una atrofia testicular que se desarrolla en un pro-ceso secuencial y que afecta de forma principal a las células ger-minales presentes en el túbulo seminífero.
3.- La secuencia puede ser caracterizada morfológicamente en los siguientes pasos
a.- Aparición de células germinales basales vacuoladas.
b.- Arresto de la proliferación de las células germinales desde las es-permatogonias.
c.- Disminución de la altura del epitelio germinal junto a un inicio de desprendimiento del mismo.
d.- Aparición de apoptosis junto a la aparición de células germinales gigantes polinucleadas.
e.- Pérdida de espermátides y por ende de espermatozoides, con vaciamiento de la luz de los conductos de la red testicular.
f.- Desaparición de células germinales en los túbulos seminíferos.
Este proceso secuencial no se da a la vez en todos los túbulos semi-níferos, sino que en un mismo
2016-01-01T00:00:00ZEstudio de las características demográficas, anatomopatológicas y supervivencia global de pacientes gastrectomizados por cáncer gástrico en el Centro de Detección de Cáncer Gástrico de Cartago, en el periodo del 2007 al 2012Machado Ramírez, Luis Guillermohttp://hdl.handle.net/10366/1282222025-06-05T12:40:28Z2015-01-01T00:00:00Z[ES]Justificación y Objetivo.
El cáncer gástrico es un problema de salud pública en el mundo. La alta incidencia y mortalidad por este cáncer motivó la creación de un Centro de Detección Temprana, en el área geográfica de mayor frecuencia en Costa Rica.
Costa Rica es un país en vías de desarrollo, programas con alto costo deben ser evaluados para determinar su impacto en la sociedad costarricense.
Este estudio tiene como objetivo describir las variables demográficas, anatomopatológicas, supervivencia global y situación actual de la población de pacientes con gastrectomía por cáncer gástrico en el Hospital Máx. Peralta de Cartago, donde se encuentra el Centro de Detección Temprana.
Material y Métodos.
El universo comprendió 310 informes clínicos de anatomía patológica de todas las gastrectomías por cáncer gástrico efectuadas del 2007 al 2012 en el Hospital Máx. Peralta de Cartago. Se procesaron los datos obtenidos con el paquete estadístico S.P.S.S. número 16. Se Obtuvieron tablas y gráficos de las variables categóricas en frecuencia y porcentaje, se confeccionaron curvas de Supervivencia de Kaplan-Meier y se elaboraron modelos de regresión logística.
Resultados.
En este estudio el cáncer gástrico fue más frecuente en hombres (54.7 %) (170), con una edad media de 60 años. El 46.6% fueron cánceres gástricos tempranos, y se localizó en todo el estómago en 36% de los casos. El tipo intestinal y poco diferenciado fueron los más frecuentes (50,4% y 50.8%).Predominó el estado ganglionar negativo en un 56.5% y el estadío IA el más frecuente (41.5%).La supervivencia global fue de 56.4% a 75 meses. Las variables de riesgo asociadas a la mortalidad fueron la edad y el estadío clínico.
Conclusiones:
El perfil del paciente gastrectomizado por cáncer gástrico es un hombre de 60.6 años vecino de Cartago Centro, con adenoma gástrico de tipo intestinal, poco diferenciado del antro gástrico con TI, sin afectación ganglionar ni metástasis a distancia que fue sometido a una gastrectomía total con disección ganglionar D2.
La Supervivencia global de los pacientes gastrectomizados fue de 64% a 5 años. Las mujeres tienen mayor supervivencia que los hombres, y es mayor arriba de 55 años de edad, y el riesgo de morir se incrementa conforme aumenta la edad y el estadío Clínico.
2015-01-01T00:00:00ZEl ácido retinoico y la retinogénesis del pez cebraCarreño Gutiérrez, Héctorhttp://hdl.handle.net/10366/1240912025-06-05T12:40:28Z2013-11-29T00:00:00Z[ES] En el presente Trabajo, y con el objetivo de aportar nuevos datos sobre la función del ácido retinoico (AR) en la retinogénesis de los vertebrados, hemos expuesto larvas de pez cebra a esta sustancia para conocer su efecto en la formación de la retina a partir de la zona periférica germinal, durante el desarrollo larvario entre los 3 y 4 dpf. También hemos expuestos a los animales a AR durante la retinogénesis embrionaria que se produce a partir de la copa óptica, entre las 24 y las 48 hpf. Además, en esta misma ventana temporal, hemos bloqueado la señal del AR inhibiendo su síntesis endógena y la unión del AR a sus receptores intracelulares. Por último, hemos analizado la retinogénesis embrionaria en animales homocigotos para la mutación del gen raldh3, que codifica para la enzima que sintetiza AR en la retina ventral. El AR interviene en la retinogénesis embrionaria y larvaria, ya que la modificación experimental de sus niveles afecta a dicho proceso. A la luz de los resultados obtenidos, hemos llegado a las siguientes conclusiones. 1. La exposición a AR durante la retinogénesis larvaria produce microftalmia y un bloqueo transitorio del crecimiento de nuevos axones del nervio óptico, probablemente debido a la falta de generación de nuevas células ganglionares de la retina.
2. La exposición a AR durante la retinogénesis embrionaria conduce a la microftalmia persistente, debida a un incremento de la muerte celular por apoptosis y a la alteración de la expresión de genes y proteínas implicadas en la neurogénesis y la diferenciación. Además, se bloquea el crecimiento de nuevos axones del nervio óptico, posiblemente debido a la pérdida de funcionalidad de la zona periférica germinal.
3. La inhibición de la síntesis de AR con DEAB y el bloqueo de la unión del AR a sus receptores nucleares RAR con AGN durante la retinogénesis embrionaria produce microftalmia debido a un retraso de la diferenciación celular dentro de la retina.
4. El déficit de la señal del AR produce el mismo tipo de alteraciones morfológicas y neuroquímicas en la retina que el exceso de la misma. Ello podría ser debido a que el exceso de esta sustancia produce una regulación de la ruta de señalización del AR que conduce a una disminución de dicha señal a largo plazo.
5. La ausencia de síntesis endógena de AR por la enzima Raldh3 no afecta a la especificación y morfogénesis de la retina del pez cebra ni parece afectar a la neurogénesis y la diferenciación celular en la misma. Este hecho podría ser debido a la existencia de mecanismos de compensación del déficit de la señalización del AR.
2013-11-29T00:00:00Z