http://hdl.handle.net/10366/133044 2026-05-01T17:55:16Z http://hdl.handle.net/10366/170354 [ES] Las RASopatías asociadas a alteraciones en los genes NF1 y SPRED1 presentan una marcada heterogeneidad clínica y molecular, donde el principal obstáculo tras el diagnóstico genético es la interpretación funcional de las variantes identificadas. Con el objetivo de superar este desafío, la presente tesis doctoral ha creado un flujo de trabajo experimental multidisciplinar que combina el análisis de variantes en NF1 y SPRED1 reportadas en bases de datos públicas y de pacientes de la DIERCyL, el modelado estructural y de estabilidad proteica in silico, la señalización celular, proliferación, y morfometría en las líneas celulares HEK293T y NIH3T3. Los análisis de las bases de datos genéticas identificaron hotspots estructurales críticos en la proteína neurofibromina (CSRD, GRD y Armadillo1), mientras que las variantes en SPRED1 mostraron una distribución homogénea, sugiriendo mecanismos patogénicos distintos. En el caso de las variantes en NF1 y SPRED1 de los pacientes, el análisis energético reveló un espectro continuo en neurofibromina que va desde haploinsuficiencia hasta dominancia negativa en truncantes tardías, mientras que en SPRED1 predominó la pérdida de función. Los ensayos celulares in vitro, mostraron dinámicas de señalización celular diferentes según el tipo de variante analizada en los genes NF1 y SPRED1. En particular, la hiperactivación de ERK emergió como el evento molecular más determinante para la patogenicidad de las variantes. La coactivación de p38 identificó variantes de mayor severidad clínica, mientras que la relación inversa p- ERK/p-AKT(Ser473) reveló un circuito de retroalimentación negativa entre las rutas de señalización MAPK y PI3K/AKT. Los ensayos de proliferación celular y el análisis cuantitativo del tamaño celular revelaron fenotipos consistentes con el grado de desregulación de MAPK, proporcionando biomarcadores fenotípicos adicionales para diferenciar entre variantes patogénicas y benignas en ambos genes. La relevancia tisular de HEK293T (contextos epiteliales/neuroectodérmicos) y NIH3T3 (mesenquimales) permitió reproducir la heterogeneidad clínica observada en pacientes. Los resultados de esta tesis doctoral han permitido reclasificar variantes de significado incierto en ambos genes e identificar la hiperactivación de ERK como diana terapéutica prioritaria, apoyando el uso de inhibidores de MEK en contextos compatibles con esta desregulación. En conjunto, este trabajo establece un marco integral para la interpretación funcional de variantes en RASopatías y para el desarrollo de futuras estrategias de medicina personalizada.; [EN] RASopathies associated with alterations in the NF1 and SPRED1 genes exhibit marked clinical and molecular heterogeneity, where the main challenge after genetic diagnosis lies in the functional interpretation of the identified variants. To address this issue, this doctoral thesis established a multidisciplinary experimental workflow that integrates the analysis of NF1 and SPRED1 variants reported in public databases and in patients from the DIERCyL cohort, together with in silico structural and protein-stability modeling, cellular signaling assays, proliferation studies, and morphometric analyses in HEK293T and NIH3T3 cell lines. Database analyses identified critical structural hotspots in neurofibromin (CSRD, GRD, and Armadillo1), whereas SPRED1 variants showed a more homogeneous distribution, suggesting distinct pathogenic mechanisms. In patient-derived NF1 and SPRED1 variants, energy-based analyses revealed a continuous spectrum in neurofibromin, ranging from haploinsufficiency to dominant-negative effects in late truncating variants, while SPRED1 alterations predominantly showed loss-of-function behavior. The in vitro cellular assays revealed distinct signaling dynamics depending on the type of variant analyzed in NF1 and SPRED1. Notably, ERK hyperactivation emerged as the most determinant molecular event for pathogenicity. Co-activation of p38 identified variants associated with more severe clinical outcomes, whereas the inverse p-ERK/p- AKT(Ser473) relationship revealed a negative feedback circuit between the MAPK and PI3K/AKT pathways. Cell-proliferation assays and quantitative cell-size analyses uncovered phenotypes consistent with the degree of MAPK deregulation, providing additional phenotypic biomarkers to discriminate between pathogenic and benign variants in both genes. The tissue relevance of HEK293T (epithelial/neuroectodermal contexts) and NIH3T3 (mesenchymal) cells allowed us to recapitulate the clinical heterogeneity observed in patients. The results of this doctoral thesis enabled the reclassification of variants of uncertain significance in both genes and identified ERK hyperactivation as a priority therapeutic target, supporting the use of MEK inhibitors in contexts consistent with this dysregulation. Taken together, this work establishes a comprehensive framework for the functional interpretation of variants in RASopathies and for the development of future personalizedmedicine strategies. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/170001 [ES] La enfermedad de Huntington (EH) es un trastorno neurodegenerativo que concurre con la acumulación de la proteína huntingtina mutante (mtHTT) en el cerebro. Aunque tradicionalmente se ha asociado con la pérdida progresiva de neuronas principalmente del estriado y en menor proporción en la corteza, evidencias recientes sugieren que los astrocitos también desempeñan un papel crucial en la etiogénesis y evolución de la enfermedad. En la EH, la disfunción del proceso autofágico contribuye a la acumulación de agregados de mtHTT, aunque aún se debate si los astrocitos participan activamente en esta alteración. La regulación de la autofagia, mediada por el sistema cannabinoide, emerge así como un mecanismo clave para comprender el progreso de la EH. Sin embargo, los efectos de los cannabinoides en esta enfermedad son controvertidos y parecen depender del tipo celular involucrado. En esta tesis doctoral, empleamos un enfoque genético mediado por partículas virales, para inducir de manera selectiva la expresión de HTT en astrocitos. El análisis de la proteostasis de agregación de HTT astrocítica in vitro, demostró que la activación cannabinoide por Δ9- tetrahidrocannabinol (THC) induce un proceso autofágico selectivo. Este medió de forma eficiente la disminución de agregados de mtHTT, así como la preservación de la función mitocondrial, mediada por mitofagia. In vivo, la expresión de mtHTT astrocítica reprodujo características clave de la EH, como gliosis, neurodegeneración y deterioro motor, que fueron prevenidas por THC. Nuestros hallazgos desafían la visión exclusivamente neurocéntrica de la EH y demuestran la relevancia patológica de la agregación de mtHTT astrocítica. El manejo de esta por el sistema cannabinoide resalta el potencial terapéutico de intervenir sobre la función astrocítica en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/169995 [ES] Belantamab mafodotin (belamaf) es un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido contra BCMA con una actividad prometedora para el mieloma múltiple en recaída/refractario (RRMM) en regímenes basados en combinaciones. Sin embargo, debido a su reciente introducción, aún no se conocen bien sus mecanismos de resistencia. Esta tesis tuvo como objetivo evaluar el potencial terapéutico de las combinaciones basadas en belamaf y esclarecer los mecanismos implicados en la resistencia adquirida, mediante modelos preclínicos y el análisis de datos clínicos. La combinación de belamaf con daratumumab mostró sinergia en líneas celulares de mieloma múltiple y modelos murinos, aumentando la citotoxicidad a dosis bajas y promoviendo la muerte celular inmunogénica. Para modelar la resistencia, se generaron líneas celulares resistentes a belamaf y se sometieron a análisis transcriptómicos y genómicos, que revelaron pérdida de expresión de BCMA y activación de vías asociadas a la respuesta inmune, la fosforilación oxidativa y la regulación del ciclo celular. La validación funcional demostró que la sobreexpresión estable de BCMA restauró completamente la sensibilidad a belamaf en uno de los modelos, mientras que en el otro solo se observó una recuperación parcial, lo que sugiere la implicación de mecanismos adicionales. Para explorar el impacto inmunológico de belamaf en un contexto clínico, se analizaron los perfiles inmunes de los pacientes incluidos en el ensayo GEM Bela-VRd, que evalúa la adición de belamaf al esquema estándar VRd (bortezomib, lenalidomida, dexametasona) en pacientes con mieloma múltiple de nuevo diagnóstico y candidatos a trasplante. Se observó una reducción de linfocitos totales y células T CD4+ en sangre periférica, sin evidencias de un fenotipo exhausto en las células efectoras. Los análisis exploratorios también mostraron una disminución progresiva de las células plasmáticas malignas y un aumento en la expresión de marcadores asociados con muerte celular inmunogénica. El recuento absoluto de linfocitos totales, células T CD8+ y células NK surgió como un posible biomarcador de respuesta, con valores más altos asociados a respuestas más profundas, tanto en el ciclo 3 como al final de la inducción. En conjunto, estos hallazgos aportan una justificación preclínica sólida para el desarrollo clínico de la combinación de daratumumab y belamaf. Paralelamente, nuestros análisis de inmunomonitorización en el ensayo GEM Bela-VRd subrayan la relevancia de seguir el perfil inmune durante el tratamiento, ofreciendo biomarcadores potenciales para guiar la evaluación de la respuesta en el mieloma múltiple.; [EN] Belantamab mafodotin (belamaf) is an antibody-drug conjugate targeting BCMA with promising activity for relapsed/refractory multiple myeloma (RRMM) in combination-based regimens. However, due to its recent introduction, its resistance mechanisms are not yet fully understood. This thesis aimed to evaluate the therapeutic potential of new belamaf-based combinations and to elucidate mechanisms underlying acquired resistance, both through preclinical models and clinical data analysis. The combination of belamaf and daratumumab exhibited strong synergy in multiple myeloma cell lines and mouse models, enhancing cytotoxicity at low doses and promoting immunogenic cell death. To model resistance, belamaf-resistant cell lines were generated and subjected to transcriptomic and genomic profiling, revealing BCMA loss, and activation of immune response, oxidative phosphorylation, and cell cycle regulation pathways. Functional validation demonstrated that stable overexpression of BCMA fully restored belamaf sensitivity in one model, while only partial restoration was observed in the other model of resistance, suggesting the implication of additional mechanisms. To further explore the immunological impact of belamaf in a clinical setting, we analyzed immune profiles from patients enrolled in the GEM Bela-VRd trial, which investigates the addition of belamaf to the standard VRd regimen (bortezomib, lenalidomide, dexamethasone) in newly diagnosed transplant-eligible MM patients. We observed a reduction in total lymphocyte and CD4+ T cells in peripheral blood, without producing an exhausted phenotype in effector cells. Exploratory analyses also showed a progressive reduction in malignant plasma cells and increased expression of markers associated with immunogenic cell death. Absolute counts of total lymphocytes, CD8+ T cells and NK cells emerged as potential biomarkers of response, with higher counts associated with deeper responses, both at cycle 3 and end of induction therapy. Together, these findings provide a strong preclinical rationale for the clinical development of the daratumumab and belamaf combination. In parallel, our immunomonitoring analyses within the GEM Bela-VRd clinical trial highlight the relevance of tracking immune profiles during treatment, offering potential biomarkers to guide response assessment in multiple myeloma. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/167323 [ES] La coordinación del estado metabólico en células neurales se establece a través de dinámicas de comunicación intercelular, donde la señalización mitocondrial emerge como un eje regulatorio fundamental. Así, la transferencia intercelular de estos orgánulos ha demostrado ser un evento fisio(pato)lógico en células neurales, con una especial relevancia en el Sistema Nervioso. Pese a los creciente avances en la caracterización estructural y funcional de la transferencia mitocondrial, su impacto sobre el remodelado metabólico en células receptoras y su correlato fisiológico en el mantenimiento metabólico del cerebro permanecen en gran parte inexplorados. Para abordar esta brecha de conocimiento, implementamos un modelo experimental in vitro que combina técnicas de trazado mitocondrial fluorescente con análisis metabólicos de alta eficiencia. Este diseño permitió estudiar la capacidad de transferencia mitocondrial entre células neurales y evaluar las consecuencias metabólicas de la adquisición de mitocondrias exógenas en astrocitos. Mediante dos enfoques - la interacción directa con neuronas primarias en co-cultivo, o la administración de mitocondrias aisladas de origen neural-, caracterizamos los posibles mecanismos de reconfiguración metabólica asociados a la internalización mitocondrial y, por ende, la función fisiológica de la transferencia mitocondrial. Los resultados obtenidos demuestran que la adquisición de mitocondrias neuronales por astrocitos induce un remodelado de la red mitocondrial y su morfología en las células receptoras. A nivel funcional, este proceso desencadena una reprogramación metabólica astrocítica mediada por mecanismos de señalización. Esta reconfiguración se manifiesta principalmente en un aumento de la β-oxidación de ácidos grasos, acompañado de una estimulación de la cetogénesis y una activación astrocitaria hacia un fenotipo reactivo. Estos cambios se traducen en un aumento de liberación de cuerpos cetónicos al medio extracelular, y previsiblemente otros factores, que pueden ser captados por las neuronas para mejorar su respiración mitocondrial. Creemos que estos hallazgos aportan una valiosa información sobre cómo la transferencia mitocondrial opera como un sistema de señalización intercelular, que orquesta la cooperación metabólica astrocito-neurona. La internalización de mitocondrias neuronales por astrocitos activa rutas catabólicas generadoras de sustratos energéticos (cuerpos cetónicos) que son transferidos de vuelta a las neuronas, estableciendo un circuito de retroalimentación positiva. Las implicaciones de este estudio trascienden al ámbito básico, revelando que la plasticidad fenotípica de los astrocitos, tanto en su estado funcional como metabólico, puede ser modulado por señales mitocondriales exógenas. Esto abre perspectivas hasta ahora inexploradas en neurobiología y enfoques terapéuticos relacionados. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/167280 [EN] Germline PTPN11 mutations drive Noonan syndrome (NS) and related RASopathies through dysregulated SHP2 function. However, the functional consequences of many of them remain poorly characterized. In this study, ten PTPN11 variants from 18 pediatric patients, including 14 diagnosed with NS and 4 with Noonan syndrome with multiple lentigines (NSML), are characterized integrating clinical data with multi-platform functional analyses. Bioinformatics analysis of ClinVar and COSMIC datasets revealed mutational hotspots concentrated in the N-SH2 regulatory and PTP catalytic domains, mirroring pathogenic variant distributions. Clinical characterization uncovered distinct genotype-phenotype correlations: variants in exons 3, 8, and 13 (c.172A>G, c.922A>G, c.1471C>A) associated with severe growth impairment and cardiac defects, while exon 12 variants (c.1403C>T) showed preserved cognition. Stable cell line models using HEK293T and NIH/3T3, revealed consistent variant-specific impacts on SHP2 protein levels and downstream signaling. Variants c.172A>G and c.922A>G induced ERK hyperactivation despite differential SHP2 expression, while c.1282G>A showed paradoxical high expression with impaired signaling. We also identified and validated the pathogenicity of a novel variant (c.1432A>G) causing thrombocytopenia and hepatosplenomegaly, expanding known oncologic risks beyond JMML. Nine of the ten variants under study exhibited gain-of-function properties, while only the NSML-linked c.1403C>T variant showed loss-of-function characteristics based on the results obtained. Transient in ovo overexpression had no major impact on chicken embryo early development, aligning with human data suggesting minimal embryonic effects. Our findings establish novel structure-function relationships in SHP2, clarify molecular mechanisms underlying phenotypic variability, and demonstrate the necessity of functional validation for variants of uncertain significance, particularly at non-canonical sites. This study establishes a framework for classifying PTPN11 variants based on their molecular and clinical effects, enabling personalized management of NS and NSML.; [ES] Mutaciones germinales de PTPN11 se relacionan con síndrome de Noonan (NS) y otras RASopatías a través de la desregulación de SHP2. Sin embargo, las consecuencias funcionales de muchas de ellas siguen poco caracterizadas. En este estudio, diez variantes de PTPN11 de 18 pacientes, incluyendo 14 con NS y 4 con NS con múltiples lentigos (NSML), se caracterizan integrando datos clínicos y análisis funcionales. Los análisis bioinformáticos de ClinVar y COSMIC revelaron hotspots mutacionales en los dominios regulador N-SH2 y catalítico PTP, reflejando la distribución de variantes patogénicas. La caracterización clínica mostró correlaciones genotipo-fenotipo: variantes en exones 3, 8 y 13 (c.172A>G, c.922A>G, c.1471C>A) se asocian a alteraciones graves del crecimiento y defectos cardíacos, mientras que variantes en exón 12 (c.1403C>T) mostraron cognición preservada. Modelos celulares estables en HEK293T y NIH/3T3 revelaron impacto consistentes y diferenciales para cada variante en los niveles de SHP2 y la señalización. Las variantes c.172A>G y c.922A>G indujeron hiperactivación de ERK a pesar de expresión diferencial de SHP2, mientras que c.1282G>A mostró expresión elevada y señalización deficiente. Se identificó y validó la patogenicidad de una variante nueva (c.1432A>G) asociada a trombocitopenia y hepatoesplenomegalia, ampliando los riesgos oncológicos más allá de JMML. Nueve variantes exhibieron ganancia de función, mientras que solo la asociada a NSML (c.1403C>T) mostró pérdida de función. La sobreexpresión transitoria in ovo no impactó significativamente el desarrollo temprano del embrión de pollo, concordando con datos humanos que sugieren efectos embrionarios mínimos. Nuestros resultados establecen nuevas relaciones estructura-función en SHP2, aclaran mecanismos moleculares detrás de la variabilidad fenotípica y destacan la necesidad de validar funcionalmente variantes de significado incierto, especialmente en sitios no canónicos. Este estudio ofrece un marco para clasificar variantes de PTPN11 según sus efectos moleculares y clínicos, facilitando una gestión personalizada de NS y NSML. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/167161 [ES] El sistema auditivo descendente cumple una función esencial en la modulación de la información sensorial, permitiendo filtrar los sonidos más relevantes según el contexto. En mamíferos, se extiende desde la corteza auditiva hasta la cóclea, mediante redes de proyecciones directas, circuitos de retroalimentación y cadenas oligosinápticas. Dentro de este sistema, el núcleo ventral del cuerpo trapezoide (NVCT), localizado en el tronco encefálico y parte del complejo olivar superior (COS), destaca por su papel en la vía auditiva descendente en las primeras etapas del procesamiento auditivo. Este núcleo presenta una notable diversidad neuroquímica, albergando neuronas colinérgicas, GABAérgicas y glicinérgicas, entre otras. Especial atención merecen las neuronas colinérgicas del sistema olivococlear medial, que proyectan a la cóclea y participan en la protección auditiva y la modulación perceptiva. Desde el punto de vista fisiológico, en el NVCT se han identificado tres tipos neuronales (PHP1, PHP2 y PHP3) con patrones específicos de respuesta y conexiones. Estas neuronas reciben modulación excitadora e inhibidora de múltiples orígenes, lo que refuerza su papel como centro integrador. En cuanto a sus conexiones, el NVCT recibe aferencias del núcleo coclear ventral, el colículo inferior y la corteza auditiva, y proyecta al colículo inferior, a núcleos del lemnisco lateral, a la cóclea y a la oliva superior lateral contralateral. Todos estos datos señalan que el NVCT participa en una compleja circuitería, modulando la actividad de muchos otros núcleos auditivos. Esta complejidad es lo que nos llevó a querer estudiar este núcleo con más detalle. En primer lugar, analizamos la proyección del NVCT al núcleo coclear dorsal (NCD), observando una proyección predominantemente contralateral y densamente ramificada en las capas superficiales del NCD. Esta proyección forma un plexo con alta densidad de botones sinápticos, con un patrón tonotópico en bandas, que recorren el núcleo en sentido rostrocaudal. Las neuronas del NVCT responsables de esta inervación tienen morfología multipolar y soma mediano, y se agrupan en los dos tercios ventrales del núcleo. La neuroquímica de esta proyección es muy probablemente GABAérgica y ejerce una influencia significativa sobre el NCD. Por tanto, esta proyección podría modular la integración audiotáctil que se produce en el NCD. Por otro lado, estudiamos las proyecciones desde los núcleos del lemnisco lateral (NLL) hacia el COS en ratas mediante trazado retrógrado. Observamos que el núcleo ventral del lemnisco lateral inerva sobre todo al NVCT y al núcleo paraolivar superior, mientras que el núcleo intermedio del lemnisco lateral inerva selectivamente al NVCT. Sin embargo, la región paralemniscal medial proyecta sobre todo a la región dorsal del COS. Durante el estudio de estas proyecciones descubrimos una nueva estructura cerebral que denominamos núcleo semilunar del lemnisco lateral (NSL), que proyecta preferentemente al núcleo medial del cuerpo trapezoide. Las proyecciones descendentes desde los NLL se organizan de forma específica, y cada núcleo del COS (excepto las olivas superiores medial y lateral) recibe aferencias distintas, siendo el NVCT el núcleo que recibe más aferencias descendentes desde los NLL. En conjunto, estos hallazgos refuerzan la visión del NVCT como un núcleo esencial en la modulación auditiva descendente, tanto por las proyecciones que recibe como por las que emite, haciendo evidente su relevancia en el procesamiento auditivo en mamíferos. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/167136 [EN] In physiological conditions, the brain primarily uses glucose as a metabolic fuel, and it does it in a highly compartmentalized manner between different cell types. Astrocytes are potent glycolytic cells, producing substantial amounts of pyruvate that is converted to lactate. Lactate is then transferred to neurons, where it is transformed back to pyruvate to fuel the tricarboxylic acid cycle. Since the inner mitochondrial membrane is impermeable to pyruvate, it enters to the mitochondrial matrix through the mitochondrial pyruvate carrier (MPC). Recent findings suggest that MPC modulation drives the metabolic reprogramming of different tissues, impacting pathways like fatty acid and glutamine metabolism. Given the central role of glucose and pyruvate in brain bioenergetics, our main objective is to understand MPC role in astrocytic metabolism, and how MPC modulation can impact on neuronal physiology and mouse cognitive performance. Our results show that MPC ablation in astrocytes does not have dramatic effect on their survivability at a resting state, since these cells were able to shunt pyruvate entry to the mitochondria through alanine transamination. Additionally, reduced ketogenesis and increased glycolysis allowed to maintain critical bioenergetic parameters unaffected. However, in energy demanding conditions, mitochondrial pyruvate uptake resulted to be necessary to maintain cellular respiration. In these conditions, fatty acids, glutamine and succinate arose as alternative bioenergetic fuel. Deleting MPC in astrocytes compromised mouse survival, impaired higher-order brain functions, and altered neuronal activity. On top of that, the levels of key metabolites and neurotransmitters were disrupted when astrocytic mitochondria lack the ability to uptake pyruvate. Our findings give a key role to mitochondrial pyruvate metabolism in astrocytes to maintain the correct balance of neuronal function and brain physiology.; [ES] En condiciones fisiológicas, el cerebro utiliza principalmente glucosa como combustible metabólico, y lo hace de manera altamente compartimentada entre distintos tipos celulares. Los astrocitos son células glucolíticas potentes, que producen cantidades significativas de piruvato, el cual se convierte en lactato. Este lactato es transferido a las neuronas, donde se transforma de nuevo en piruvato para alimentar el ciclo del ácido tricarboxílico. Dado que la membrana mitocondrial interna es impermeable al piruvato, este ingresa a la matriz mitocondrial a través del transportador mitocondrial de piruvato (MPC). Hallazgos recientes sugieren que la modulación del MPC impulsa la reprogramación metabólica de distintos tejidos, afectando vías como el metabolismo de ácidos grasos y glutamina. Considerando el papel central de la glucosa y el piruvato en la bioenergética cerebral, nuestro objetivo principal es comprender el rol del MPC en el metabolismo astrocítico y cómo su modulación impacta en la fisiología neuronal y el desempeño cognitivo en ratones. Nuestros resultados demuestran que la ablación de MPC en astrocitos no tiene un efecto drástico en su supervivencia en estado basal, ya que estas células logran desviar la entrada de piruvato a las mitocondrias mediante la transaminación de alanina. Además, la reducción de la cetogénesis y el aumento de la glucólisis permiten mantener los parámetros bioenergéticos críticos sin alteraciones. Sin embargo, en condiciones de alta demanda energética, la captación mitocondrial de piruvato resultó ser necesaria para sostener la respiración celular. En estos casos, los ácidos grasos, la glutamina y el succinato intervienen también como combustibles bioenergéticos alternativos. La eliminación de MPC en astrocitos comprometió la supervivencia de los ratones, deterioró funciones cerebrales superiores y alteró la actividad neuronal. Asimismo, los niveles de metabolitos clave y neurotransmisores se vieron alterados cuando las mitocondrias astrocíticas perdieron la capacidad de importar piruvato. Estos hallazgos otorgan un papel clave al metabolismo mitocondrial de piruvato en astrocitos para mantener el equilibrio correcto de la función neuronal y la fisiología cerebral. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/166640 [ES] Antecedentes: La microbiota intestinal y sus subproductos son cada vez más reconocidos por tener un papel decisivo en las enfermedades cardiovasculares. Investigaciones recientes destacan el papel potencial de las variaciones específicas según el sexo en estas patologías, demostrándose que el microbioma intestinal difiere entre los sexos en pacientes con factores de riesgo cardiovascular. Este estudio tiene como objetivos analizar la relación entre la microbiota intestinal y el envejecimiento vascular precoz (EVA), así como examinar las diferencias entre mujeres y hombres en la relación entre la microbiota intestinal y las medidas de rigidez arterial. Métodos: Se desarrolló un estudio observacional de casos y controles en Salamanca (España) en el que se reclutaron 180 sujetos (122 mujeres, 58 hombres) con edades entre 45 y 74 años. El EVA y la rigidez arterial se definieron por la presencia de al menos uno de los siguientes parámetros: velocidad de onda de pulso carótida-femoral (cf-PWV) superior a 12 m/s, índice vascular cardio-tobillo (CAVI) superior a 9, o velocidad de onda de pulso brazo-tobillo (ba-PWV) superior a 17.5 m/s, o por encima del percentil 90 de la población de referencia. Los sujetos que no cumplían estos criterios fueron considerados con envejecimiento vascular normal (NVA) o sin rigidez arterial. La cf-PWV se midió mediante el sistema SphygmoCor; CAVI y ba-PWV se determinaron mediante el dispositivo Vasera 2000. La composición del microbioma intestinal en muestras fecales se determinó mediante secuenciación Illumina de ARNr 16S. Resultados: La edad media fue de 64,4 ± 6,9 años en el grupo EVA (n = 81) y 60,4 ± 7,6 años en NVA (n = 99) (p < 0,01). Las mujeres representaron el 41% en el grupo EVA y el 53% en NVA. No hubo diferencias en la composición general de la microbiota intestinal entre los grupos EVA y NVA al evaluar la proporción Firmicutes/Bacteriodetes, diversidad alfa (Índice de Shannon) y diversidad beta (Bray-Curtis). Sin embargo, los géneros Bilophila, Faecalibacterium sp. UBA1819 y Phocea estaban aumentados en el grupo EVA, mientras que Cedecea, Lactococcus, Pseudomonas, Succiniclasticum y Dielma se encontraron en menor abundancia. En el análisis de regresión logística, Bilophila (OR: 1,71, IC 95%: 1,12-2,6, p = 0,013) mantuvo significación estadística. Al analizar las diferencias por sexo, encontramos que las mujeres tienen un microbioma más diverso que los hombres (Shannon, p < 0.05) y existe una diferencia significativa en la composición de la microbiota intestinal entre sexos (Bray-Curtis, p < 0.01). Dorea, Roseburia y Agathobacter, todos ellos productores de ácidos grasos de cadena corta, fueron más abundantes en la microbiota de las mujeres (valores logarítmicos > 1, valor p y FDR < 0.05). Además, Blautia fue más abundante en mujeres cuando solo se consideraron los sujetos con rigidez arterial. De acuerdo con la regresión logística, Roseburia se asoció negativamente con la rigidez arterial en hombres, mientras que Bifidobacterium y Subdoligranulum se relacionaron positivamente con la rigidez arterial. Conclusiones: En la población española estudiada, el envejecimiento vascular precoz está positivamente asociado con la abundancia en la microbiota intestinal del género Bilophila, sin encontrarse relación entre la abundancia de filos y las medidas de diversidad. Adicionalmente, las mujeres presentaron mayor diversidad del microbioma y géneros potencialmente protectores, y el género del huésped determina la influencia de las mismas bacterias en la rigidez arterial. Estos hallazgos subrayan la importancia de considerar las diferencias por sexo al estudiar la relación entre microbiota intestinal y salud cardiovascular.; [EN] Background: Gut microbiota and its byproducts are increasingly recognized as having a decisive role in cardiovascular diseases. Recent research highlights the potential role of sex-specific variations in these pathologies, demonstrating that the intestinal microbiome differs between sexes in patients with cardiovascular risk factors. This study aims to analyze the relationship between gut microbiota and early vascular aging (EVA) and examine differences between women and men in the relationship between gut microbiota and measures of arterial stiffness. Methods: A cross-sectional study was conducted in Salamanca (Spain), recruiting 180 subjects (122 women, 58 men) aged between 45 and 74 years. EVA and arterial stiffness were defined by the presence of at least one of the following parameters: carotid-femoral pulse wave velocity (cf-PWV) above 12 mm/s, cardio-ankle vascular index (CAVI) above nine, or brachial-ankle pulse wave velocity (ba- PWV) above 17.5 m/s, or above the 90th percentile of the reference population. Subjects who did not meet these criteria were considered to have normal vascular aging (NVA) or no arterial stiffness. The cf-PWV was measured using the SphygmoCor system; CAVI and ba-PWV were determined using the Vasera 2000 device. Gut microbiome composition in fecal samples was determined by Illumina sequencing of 16S rRNA. Results: The mean age was 64.4 ± 6.9 years in the EVA group and 60.4 ± 7.6 years (n=81) in the NVA group (n=99) (p < 0.01). Women represented 41% in the EVA group and 53% in the NVA group. There were no differences in the overall composition of gut microbiota between the EVA and NVA groups when evaluating the Firmicutes/Bacteriodetes ratio, alpha diversity (Shannon Index), and beta diversity (Bray-Curtis). However, the genera Bilophila, Faecalibacterium sp. UBA1819, and Phocea were increased in the EVA group, while Cedecea, Lactococcus, Pseudomonas, Succiniclasticum, and Dielma were found in lower abundance. In the logistic regression analysis, Bilophila (OR: 1.71, 95% CI: 1.12- 2.6, p = 0.013) maintained statistical significance. When analyzing sex differences, we found that women have a more diverse microbiome than men (Shannon, p < 0.05) and there is a significant difference in gut microbiota composition between sexes (Bray-Curtis, p < 0.01). Dorea, Roseburia, and Agathobacter, all short-chain fazy acid producers, were more abundant in women's microbiota (log values > 1, p-value and FDR < 0.05). Additionally, Blautia was more abundant in women when only subjects with arterial stiffness were considered. According to logistic regression, Roseburia was negatively associated with arterial stiffness in men, while Bifidobacterium and Subdoligranulum were positively related to arterial stiffness. Conclusions: In the Spanish population studied, early vascular aging is positively associated with the abundance of the genus Bilophila in the gut microbiota, with no relationship found between phyla abundance and diversity measures. Additionally, women presented greater microbiome diversity and potentially protective genera, and host sex determines the influence of the same bacteria on arterial stiffness. These findings underscore the importance of considering sex differences when studying the relationship between gut microbiota and cardiovascular health. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/166575 [ES] El manejo clínico de los SMD con del(5q) con anemia dependiente de transfusiones es ampliamente conocido, si bien, la evolución clínica, las características biológicas y el manejo terapéutico de los pacientes que presentan anemia sin requerir de soporte transfusional no está claro y constituye una necesidad terapéutica no cubierta en el momento actual. Dados los buenos resultados de lenalidomida a dosis estándar para el tratamiento en indicación (SMD del(5q) y dependencia transfusional) nos planteamos: 1. Si el tratamiento precoz con lenalidomida en enfermos con SMD del(5q), antes de iniciar las necesidades transfusionales mejora los resultados respecto al tratamiento convencional (observación hasta desarrollo de dependencia transfusional). 2. El tratamiento con lenalidomida se ha asociado, en ocasiones, con la aparición de efectos secundarios indeseables entre los que se incluye la evolución clonal de estos enfermos, si bien los resultados no son concluyentes. Por ello, el estudio detallado de la tolerancia y seguridad de este fármaco permitiría determinar su seguridad en el tratamiento del SMD del(5q) previo al desarrollo de la dependencia transfusional. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/163929 [ES]El cáncer es un conjunto de enfermedades genéticas caracterizadas por el crecimiento celular descontrolado, con más de 100 tipos identificados. Los riesgos para desarrollar cáncer se clasifican en factores modificables (como el consumo de alcohol y tabaco) y no modificables. El estudio examina el metabolismo de las células cancerosas y su capacidad para evadir el sistema inmunitario. Se destaca la importancia de los síndromes hereditarios asociados a mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, que son relevantes en la reparación del ADN y en la prevención del cáncer 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/163717 [ES]En múltiples enfermedades, tanto en episodios agudos como en su cronificación, se ha observado una disfunción de la respuesta inmune (tanto a nivel celular como humoral). Entre estas patologías se encuentran COVID-19 y Leucemia Linfocítica Crónica (LLC). En ambos casos, se ha descrito cómo la disfunción de la respuesta inmune está relacionada con la dinámica de la respuesta humoral que, a su vez, se asocia con la evolución y el progreso de la enfermedad. En este sentido, diversos mecanismos pueden determinar la disfunción de la respuesta inmune como (1.) el reconocimiento, procesamiento y presentación antigénica, (2.) la regulación de la señalización intracelular, (3.) el microambiente celular mediante inmunosupresión y/o agotamiento celular. En su conjunto, se produce una disfunción de la respuesta humoral asociada a una progresión más rápida y agresiva de estas patologías. La caracterización de estos mecanismos subyacentes es una fuente muy valiosa para la determinación de biomarcadores de utilidad en el diagnóstico, pronóstico y evolución de la enfermedad. Asimismo, estos biomarcadores de disfunción inmune pueden tener potencial relevancia en la estratificación y el tratamiento de los pacientes. En esta Tesis Doctoral, se ha realizado una caracterización sistemática de la respuesta humoral mediante metodologías avanzadas de Proteómica Clínica (basadas en microarrays y en espectrometría de masas). Se han estudiado perfiles inflamatorios (mediante un panel de reactantes de fase aguda), presencia de autoanticuerpos, perfiles serológicos (IgM e IgG) frente a microorganismos más prevalentes y perfiles proteómicos diferenciales de células B para evaluar la señalización intracelular. Todo ello, permite evaluar las alteraciones en la respuesta humoral tanto en pacientes con COVID-19 como en pacientes con LLC, en distintos estadios de la enfermedad. Los resultados describen perfiles proteicos significativamente diferenciales de acuerdo a la gravedad y a la evolución en ambas enfermedades. En resumen, la caracterización proteómica, sistemática y exhaustiva de la respuesta humoral ha permitido establecer un panel de potenciales biomarcadores proteicos de interés tanto para el diagnóstico y pronóstico como para la estratificación de grupos de pacientes y su seguimiento clínico. 2024-12-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/163571 [ES]La reutilización de fármacos, también conocida como "drug repurposing", es una estrategia que identifica nuevos usos de medicamentos aprobados para tratar condiciones diferentes a las de su propósito original. Ofrece un enfoque más simplificado para el desarrollo de nuevos tratamientos, ya que los medicamentos reutilizados han pasado por pruebas rigurosas de seguridad y eficacia. En este contexto, la enzalutamida, un medicamento desarrollado inicialmente para el tratamiento del cáncer de próstata, ha surgido como un candidato para la terapia del cáncer de mama. Estudios recientes han demostrado que la enzalutamida muestra una eficacia comparable tanto en líneas celulares de TNBC como en líneas no TNBC, aunque su efectividad dependía de la presencia de AR227. Es importante destacar que solo un subconjunto de pacientes con TNBC tiene tumores que expresan AR, lo que sugiere que los inhibidores de AR podrían ser especialmente beneficiosos para este subgrupo. Un ensayo clínico de fase II (NCT01889238) evaluó la eficacia y seguridad de la enzalutamida en pacientes con TNBC localmente avanzado o metastático con más del 10% de expresión de AR en las células tumorales. Los pacientes del estudio fueron administrados con 160 mg enzalutamida una vez al día hasta la progresión de la enfermedad. La evaluación de la respuesta se realizó cada 8 semanas durante los primeros 12 meses y luego cada 12 semanas mediante métodos radiológicos estándar. Figura 18. Variantes de splicing de AR. El exón 1 codifica el NTD, los exones 2 y 3 codifican el DBD, el exón 4 codifica la región bisagra o hinge y los exones 5, 6, 7 y 8 codifican el LBD y CTD. AR-V567es es una variante de splicing que carece de los exones 5-7 con un codón de parada en el exón 8. AR-V7 contiene los exones 1-3, lo que lleva a la adición de un nuevo exón críptico 3. Los pacientes que suspendieron el tratamiento por razones ajenas a la progresión de la enfermedad continuaron con evaluaciones de imágenes hasta confirmar la progresión. De los 118 pacientes inscritos, 78 fueron evaluables. La tasa de beneficio clínico a las 16 semanas fue del 33% en el subgrupo evaluable. La mediana de supervivencia libre de progresión fue de 3.3 meses en el subgrupo evaluable. La mediana de supervivencia global fue de 17,6 meses en el subgrupo evaluable. Por tanto, el estudio informó de una actividad clínica prometedora y un perfil de seguridad favorable para la enzalutamida en pacientes con TNBC AR+ avanzado. Los eventos adversos observados fueron consistentes con el perfil de seguridad conocido de la enzalutamida, lo que subraya la necesidad de seguir explorando este medicamento como una opción de tratamiento para el cáncer de mama. Posteriormente, la enzalutamida se ha combinado con varias terapias en el tratamiento del cáncer de mama AR+, mejorando la eficacia del tratamiento. Se han evaluado combinaciones con quimioterapia, como paclitaxel228, así como con terapias dirigidas, como inhibidores de PI3K y CDK4/6 como palbociclib229 o ribociclib230 en tumores TNBC. También se ha probado junto con terapias endocrinas, como exemestano y fulvestrant231–233, en pacientes con tumores ER+ y con inhibidores de HER2, como trastuzumab234. 2024-12-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/163558 [ES]El objetivo principal del presente trabajo es desarrollar y caracterizar un modelo in vitro de hRPE que reproduzca de manera fidedigna las propiedades fisiológicas del tejido in vivo, y cuya finalidad sea servir como plataforma de estudio de la fisiopatología de enfermedades oculares como la DMAE. Se espera que este modelo permita la comparación entre fenotipos normales y patológicos, así como la realización de modificaciones genéticas eficaces para estudiar la función de genes relacionados con esta patología. Con el fin de alcanzar este objetivo, en primer lugar, se evaluó la posibilidad de establecer un modelo in vitro utilizando células de hRPE adulto. Esta decisión estuvo motivada por la implementación de regulaciones más estrictas sobre el uso de células fetales en investigación, lo que condujo a descatalogar un modelo comercial a partir de células de origen fetal, que había sido ampliamente caracterizado y validado en nuestro laboratorio. Por tanto, se hizo necesario establecer un nuevo modelo experimental que ofreciera las mismas ventajas en términos de accesibilidad, rapidez, eficiencia y fidelidad con el hRPE in vivo. En el presente trabajo, en primer lugar, se ha llevado a cabo un análisis comparativo con el objetivo de evaluar la influencia de dos tipos de medios de cultivo, comercial de Lonza y retinal maturation media (RMM), sobre la madurez y polaridad celular de los modelos in vitro generados a partir de células de hRPE de origen adulto y fetal. En los grupos experimentales de células de origen fetal cultivadas con medio Lonza y adultas con medio RMM, se observó una densidad y un área celular similares a los encontrados en la mácula humana in vivo. Sin embargo, el análisis de marcadores de polaridad (uniones ocluyentes, complejos de polaridad, citoesqueleto y conductancia iónica) reveló que únicamente el modelo de origen fetal con Lonza presenta una distribución equiparable a la del RPE humano in vivo. En segundo lugar, en base a los resultados obtenidos y con el objetivo de optimizar el modelo de RPE de origen adulto, se evaluó el impacto de diferentes condiciones de cultivo, como el soporte, el material de la matriz y la densidad de sembrado. Si bien el soporte no afectó la viabilidad, se determinó que la matriz de recubrimiento a emplear debía adaptarse en función del origen celular. Además, se observó que el aumento de la densidad de sembrado mejoró la organización y polaridad celular es en el modelo obtenido a partir de células de origen fetal con RMM, pero no en las células de origen adulto. En tercer y último lugar, se generaron 3 nuevos modelos de hRPE a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) control y a partir de poblaciones heterogéneas con deleciones en los genes CRB2 y VEGFA. Se analizaron estas moléculas porque la proteína CRB2 es esencial para preservar la polaridad apicobasal del hRPE, una propiedad que se pierde durante los procesos patológicos de la DMAE y porque, por otra parte, el aumento de secreción de VEGFA contribuye al desarrollo de la DMAE exudativa. Los nuevos modelos de hRPE se compararon los de origen fetal y adulto. Los resultados revelaron que las células derivadas de iPS mostraron una mayor producción de melanina. De todos los grupos estudiados, solo las células de origen fetal, las derivadas de iPS control y las derivadas de un pool de iPS sin VEGFA forman monocapas sin alteraciones. Además, el análisis morfométrico reveló que las células de hRPE de origen fetal y adulto tienden a ser más alargadas que las derivadas de iPS. En cuanto a su polaridad, las células de origen fetal y derivadas de iPS manifestaron complejos de unión, complejos de polaridad, distribución del citoesqueleto, proteínas del ciclo visual y transportadores iónicos consecuentes con el hRPE in vivo. Sin embargo, los valores de TEER obtenidos en las células iPS indicaron una barrera epitelial menos efectiva. 2024-12-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/161233 [SPA] Señalización celular se define como el proceso en el que las células interactúan con su entorno respondiendo a los diferentes estímulos que reciben del exterior generando respuestas frente a estos. Su descubrimiento se remonta al año 1855 de la mano de Claude Bernard cuando describió cómo las secreciones de glándulas carentes de ductos se liberaban al torrente sanguíneo y parecían ejercer cierto efecto sobre células distantes [1]. Esta recepción y respuesta a estímulos por parte de las células se da gracias a moléculas que se encuentran en la membrana celular y a complejas redes de señalización internas que conectan generalmente receptores de membrana con diversos sustratos intracelulares. De entre las vías de señalización más estudiadas en humanos destacan la vía de PI3K/Akt (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (AKT)) y las vías de MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinase). En esta sección nos enfocaremos en las vías de MAPK 2024-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/161095 [ES]La hematopoyesis es el proceso por el cual se generan todos los componentes celulares de la sangre. Este proceso se da de forma activa durante toda la vida y, en adultos, se lleva a cabo en la médula ósea (BM, por sus siglas en inglés), donde una limitada población de células, conocidas como células madre hematopoyéticas (HSC), con capacidad de autorrenovación y diferenciación es capaz de generar los distintos progenitores restringidos que darán finalmente lugar a las poblaciones celulares maduras de la sangre. Las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) permanecen en un estado quiescente, pero pueden ser activadas en respuesta a diversos factores de estrés tales como infección, ablación de la BM, o trasplante. Por ello, un adecuado balance entre la capacidad de autorrenovación y diferenciación de las HSC ha de ser estrictamente regulado para evitar que las reservas de HSPC se agoten o proliferen en exceso, lo que podría dar lugar a la aparición de enfermedades mieloproliferativas o leucemias. En esta regulación participa el microentorno específico de las HSPC, conocido como “nicho”. Este se compone de diferentes tipos celulares: megacariocitos (MK), adipocitos (BMA), células del tejido óseo, macrófagos, células perivasculares, células endoteliales y células madre mesenquimales. Todas estas poblaciones son capaces de modular la quiescencia, migración y diferenciación de las HSC, bien a través de interacciones directas célula-célula o mediante la secreción de multitud de factores...En conclusión, este trabajo demuestra el papel de C3G en la determinación del destino celular en diferentes niveles dentro de la jerarquía hematopoyética, promoviendo la diferenciación hacia el linaje mieloide. Además, la participación de C3G en la vía de TPO/c-Mpl, con implicaciones en MPN y otras enfermedades hematológicas, convierte a C3G en una potencial diana terapéutica y/o en un marcador pronóstico de tumores hematopoyéticos. 2024-10-18T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/160622 [ES] Existe amplia evidencia en la literatura de que tanto la preeclampsia como los trastornos del crecimiento intrauterino están significativamente asociados con alteraciones en la síntesis de mediadores bioquímicos y moleculares, y la liberación de vesículas extracelulares (exosomas) que modulan los micro RNA mensajeros, contribuyendo a una comunicación celular defectuosa que afecta tanto al desarrollo fetal como a la salud materna. Sin embargo, la comprensión detallada de estos mecanismos en el contexto de la preeclampsia y los trastornos del crecimiento intrauterino aún es limitada. Por este motivo, nuestra hipótesis de trabajo a la hora de plantear esta tesis fue tratar de conocer con más detalle la influencia de los exosomas como mediadores de la comunicación intercelular en la fisio patogenia de estas patologías. 2024-01-01T00:00:00Z