http://hdl.handle.net/10366/143124 2026-06-11T23:33:47Z http://hdl.handle.net/10366/170443 [ES] El daño renal agudo (DRA) es una complicación frecuente y clínicamente relevante en el posoperatorio inmediato del trasplante pulmonar (TXP). Partiendo de la hipótesis de que muchos pacientes llegan al quirófano con un estado premórbido de “fragilidad renal”, una condición de vulnerabilidad subclínica no siempre detectable mediante la tecnología diagnóstica convencional, esta tesis explora si dicha fragilidad puede identificarse antes de la cirugía combinando variables clínicas y, fundamentalmente, biomarcadores de estado funcional y tisular renal mediante tecnología de inteligencia artificial, concretamente el aprendizaje automático (machine learning, ML). Objetivo: Generar una prueba de concepto para un sistema de diagnóstico preoperatorio de fragilidad renal capaz de anticipar el riesgo de DRA temprano tras el TXP, con dos aproximaciones: (1) Por una parte, mediante la evaluación del poder predictivo individual de variables generales y de función renal del paciente; y (2) por otra, mediante el desaarrollo de un modelo multivariable de ML que identifique e integre la información complementaria aportada por estas variables para caracterizar la fragilidad renal. Métodos: Se realizó un estudio de cohorte, observacional y prospectivo (ULS São José/Hospital de Santa Marta, 2018–2021). Se incluyeron 104 receptores de TXP. Con ellos se conformó una muestra emparejada por edad y sexo con pacientes que sufrieron un DRA y que no lo sufrieron (68 pacientes en total: 34 DRA y 34 No-DRA). Se analizaron variables demográficas y clínicas (comorbilidades habituales) y una batería de indicadores renales preoperatorios, incluidos biomarcadores urinarios de filtración glomerular y función tubular: creatinina sérica y urinaria, urea en sangre, TCP1, NAG, transferrina y GM2AP. El modelo empleó variables categóricas y algoritmos basados en árboles de decisión (Random Forest y ExtraTrees) con validación leave-one-out y evaluación mediante curvas ROC. El mejor modelo se repitió 100 veces para evaluar la variabilidad del rendimiento debido a la inicialización aleatoria de los algoritmos. Resultados principales: La incidencia de DRA (según loscriterios KDIGO) en las dos primeras semanas posteriores al TXP fue del 32,7% en la cohorte total, lo que confirma su elevada prevalencia en el TXP. Las variables del paciente (edad, sexo, índice de masa corporal, hipertensión arterial, diabetes, tabaquismo), el diagnóstico pulmonar y el tipo de TXP no mostraron asociación robusta independiente con el DRA temprano, probablemente por el sesgo de selección propio de los programas de trasplante. Los biomarcadores de función renal no mostraron, individualmente, ninguna capacidad de discriminación (AUC≈0,5–0,6). Sin embargo, al integrar múltiples variables y categorizarlas, el mejor modelo multidimensional de ML basado en la edad, la creatinina sérica, la creatinina urinaria, la proteinuria, el TCP1 y la transferrina alcanzó una AUC de 0,89 y una exactitud del 84%, que muestra la capacidad clínica potencial para estratificar el riesgo antes de la cirugía. Aportación conceptual: La tesis define la fragilidad renal en el contexto del TXP como un fenotipo de reserva renal disminuida (vulnerabilidad sin lesión establecida), que explica la pobre capacidad predicitva de los biomarcadores en el momento preoperatorio y la mejora sustancial al analizarlos de forma integrada mediante inteligencia artificial. Este enfoque desplaza la predicción desde lo reactivo (“vigilar la creatinina tras la cirugía”) hacia lo proactivo (“paciente frágil: protección renal intensiva desde el preoperatorio”), alineada con los principios de la medicina preventiva y personalizada. 4 Implicaciones clínicas: Un sistema diagnóstico y predictivo preoperatorio de fragilidad renal permitirá: (i) activar paquetes de actuaciones de prevención (care bundles) de DRA (optimización hemodinámica, control glucémico, minimización de nefrotóxicos, gestión de fluidos), (ii) ajustar el uso de ECMO/CEC y sus parámetros, y (iii) priorizar la vigilancia analítica y hemodinámica durante todo el periodo perioperatorio. Limitaciones: La monocentricidad, el tamaño muestral moderado, la falta de validación externa independiente, y el entorno clínico específico pueden limitar la generalización de los resultados. Conclusión: Ningún predictor preoperatorio aislado anticipa con fiabilidad el DRA temprano tras el TXP. Sin embargo, un modelo multivariable de ML que integra variables clínicas y biomarcadores de estado funcional y tisular renal identifica con alto rendimiento a los pacientes con fragilidad renal y alto riesgo de DRA, lo que abre una ventana anticipatoria y eficaz real para la prevención, que debe ser estudiada con mayor profundidad en nuevos estudios 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/170431 [ES] La enfermedad renal crónica (ERC) constituye un importante problema de salud pública, cuya prevalencia e incidencia van en aumento a nivel mundial. Su carácter progresivo, la ausencia de tratamientos curativos y la necesidad de terapias sustitutivas suponen un elevado coste sanitario y social, además de un notable impacto sobre la calidad y la esperanza de vida de los pacientes. En este contexto, el daño renal agudo (DRA) ha adquirido un papel central, al reconocerse su estrecha relación con el desarrollo y la evolución de la ERC. La evidencia clínica y experimental indica que, lejos de ser un evento aislado, el DRA puede dejar secuelas estructurales que pasan clínicamente desapercibidas favoreciendo la progresión hacia la ERC. Para abordar esta conexión, se desarrolló un nuevo modelo experimental in vivo capaz de reproducir la transición del DRA hacia la ERC, con el fin de identificar biomarcadores urinarios asociados a este proceso y evaluar nuevas estrategias terapéuticas para frenar o revertir esta transición, como es el uso de la empagliflozina, un inhibidor del cotransportador sodio-glucosa 2 (iSGLT2). El modelo se basó en la combinación de dos tipos de daño renal, uno nefrotóxico (tratamiento con el antineoplásico cisplatino), y otro isquémico, (isquemia-reperfusión unilateral). Se realizó una caracterización funcional, estructural y molecular mediante la determinación de la función renal, análisis histológicos y la cuantificación de la expresión génica de marcadores de inflamación y fibrosis. Sobre esta base, se efectuó un análisis proteómico diferencial de la orina para identificar proteínas diferencialmente excretadas durante la transición de DRA a ERC y, posteriormente, se evaluó el efecto de la empagliflozina administrada a una dosis de 20 mg/kg/día desde el momento del establecimiento del modelo. La combinación de los dos daños induce una lesión renal persistente caracterizada por procesos fibróticos e inflamatorios que evolucionan de forma progresiva hacia la disminución de la función renal, reproduciendo la transición hacia la ERC. El análisis proteómico permitió identificar un conjunto de proteínas urinarias asociadas a distintos procesos como la respuesta inflamatoria, el estrés oxidativo y el remodelado tisular, que representan potenciales biomarcadores de esta transición. Finalmente, el tratamiento con empagliflozina atenuó la pérdida de la función renal y redujo notablemente las alteraciones histológicas y moleculares. En conclusión, este trabajo identifica nuevos biomarcadores urinarios implicados en la transición de DRA a ERC en un modelo experimental bien caracterizado para el estudio de esta transición y demuestra el potencial de la empagliflozina como estrategia terapéutica en este proceso.; [EN] Chronic kidney disease (CKD) represents a major public health problem whose prevalence and incidence are steadily increasing worldwide. Its progressive nature, the lack of curative treatments, and the frequent need for renal replacement therapy impose a substantial healthcare and social burden, as well as a significant impact on patients quality of life and life expectancy. Within this context, acute kidney injury (AKI) has gained a central role due to its close association with the onset and progression of CKD. Clinical and experimental evidence indicates that, far from being an isolated event, AKI can leave subclinical structural sequelae that promote the progression toward CKD. To address this connection, a novel in vivo experimental model was developed to reproduce the transition from AKI to CKD, with the aim of identifying urinary biomarkers associated with this process and evaluating new therapeutic strategies to halt or reverse this transition, such as the use of empagliflozin, a sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor (iSGLT2). The model combined two types of renal injury, one nephrotoxic (treatment with the antineoplastic drug cisplatin) and one ischemic (unilateral ischemia-reperfusion). A comprehensive functional, structural, and molecular characterization was performed through renal function assessment, histological analysis, and quantification of gene expression markers of inflammation and fibrosis. On this basis, a differential urinary proteomic analysis was conducted to identify proteins differentially excreted during the AKI-to-CKD transition, followed by the evaluation of the effect of empagliflozin administered at a dose of 20 mg/kg/day from the onset of the established model. The combination of the two injuries induced a persistent renal lesion characterized by fibrotic and inflammatory processes that progressively led to renal dysfunction, thus reproducing the transition toward CKD. The proteomic analysis enabled the identification of a set of urinary proteins associated with key processes such as inflammatory response, oxidative stress, and tissue remodeling, which represent potential biomarkers of this transition. Finally, treatment with empagliflozin attenuated the loss of renal function and markedly reduced histological and molecular alterations. In conclusion, this work identifies novel urinary biomarkers involved in the AKI-to-CKD transition in a well-characterized experimental model designed to study this process, and demonstrates the potential of empagliflozin as a therapeutic strategy to mitigate this transition. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/170195 [EN] El adenocarcinoma de pulmón es el subtipo más frecuente de cáncer de pulmón y presenta una elevada heterogeneidad biológica. Un aspecto clave de su progresión es la vascularización tumoral, que puede producirse tanto mediante angiogénesis, que es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya preexistentes, como por co-optación vascular, proceso por el cual las células tumorales utilizan los capilares preexistentes. Por otro lado, endoglina (CD105), co-receptor del TGF-ß expresado en endotelio activado, se ha relacionado con angiogénesis y mal pronóstico, y el anticuerpo anti-endoglinaTRC105 ha sido evaluado como terapia antiangiogénica. En esta tesis se caracterizaron los patrones vasculares en muestras humanas de adenocarcinoma pulmonar y se evaluó el papel de CD105 y GLUT-1 como posibles biomarcadores útiles para diferenciar entre una vasculatura angiogénica y una vasculatura por co-optación vascular. Asimismo, se emplearon dos modelos murinos de adenocarcinoma de pulmón, uno de inyección intravenosa de células tumorales y otro inducido por el carcinógeno uretano, para estudiar el efecto de los distintos niveles de endoglina y del TRC105 en la vasculatura tumoral. Los resultados muestran que angiogénesis, co-optación y patrones mixtos coexisten en los tumores humanos. Además, CD105 y GLUT-1 no permiten discriminar de forma específica entre mecanismos vasculares. En los modelos experimentales se observó que la vascularización es un proceso dinámico: en el modelo intravenoso progresa hacia angiogénesis, mientras que en el de uretano tiende a la co-optación en fases avanzadas de la enfermedad. Por otro lado, la sobreexpresión de endoglina se asoció a tumores de mayor tamaño y agresividad y el TRC105 no redujo la carga tumoral ni mejoró la supervivencia, pero sí modificó los patrones de vascularización. En conjunto, estos hallazgos confirman que la vascularización tumoral en el adenocarcinoma de pulmón es dinámica y heterogénea, y endoglina actúa como modulador más que como marcador exclusivo de angiogénesis. Además, se refuerza la idea de que el valor clínico de TRC105 podría residir en su uso combinado y en ventanas terapéuticas concretas, más que en monoterapia. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/169992 [ES] La fasciolosis es una enfermedad parasitaria causada principalmente por el trematodo Fasciola hepatica. Hay una creciente preocupación a nivel mundial por esta patología, tanto a nivel de salud humana como animal, ya que la capacidad del parásito para infectar a una amplia variedad de hospedadores mamíferos, junto con su adaptabilidad a diversas condiciones climáticas, ha favorecido su expansión a nuevas regiones, impulsada además por el calentamiento global y determinadas prácticas agropecuarias. Reconocida por la Organización Mundial de la Salud como una Enfermedad Tropical Desatendida, la fasciolosis afecta aproximadamente a 17 millones de personas, con más de 90 millones en riesgo. Además, ocasiona importantes pérdidas económicas en la industria ganadera, principalmente ovina y vacuna, estimadas en hasta 3.000 millones de dólares anuales, debido a la disminución de la productividad, la mortalidad y los costes asociados al tratamiento. El tratamiento de la fasciolosis sigue dependiendo del uso de fármacos antihelmínticos. No obstante, la creciente aparición de resistencias compromete su eficacia, lo que convierte el desarrollo de vacunas en una prioridad urgente. A pesar de los avances en el conocimiento de la biología de F. hepatica, las etapas iniciales de la migración del parásito dentro del hospedador vertebrado (definitivo), durante las cuales los vermes juveniles atraviesan la barrera intestinal, se desplazan por la cavidad peritoneal y penetran en el hígado, han sido relativamente poco exploradas a nivel molecular, a pesar de que representan momentos clave para el establecimiento de la infección. En este contexto, una comprensión profunda de las interacciones parásito-hospedador en estas etapas tempranas podría resultar en la identificación de nuevos candidatos vacunales. Actualmente, las tecnologías ómicas de última generación están ampliando significativamente el conocimiento molecular sobre F. hepatica, siendo la proteómica un vínculo esencial entre su genoma y la biología del parásito. En el marco de esta Tesis Doctoral, dicha aproximación ha resultado fundamental para identificar la expresión de proteínas específicas del parásito durante las fases iniciales de la infección en el hospedador definitivo. Se emplearon dos técnicas avanzadas de espectrometría de masas basadas en adquisición de datos independientes (data-independent acquisition, DIA): SWATH-MS (Sequential Window Acquisition of All Theoretical Mass Spectra), que permite la cuantificación reproducible de miles de péptidos, y diaPASEF (Parallel Accumulation–Serial Fragmentation combinado con DIA), que ofrece mayor sensibilidad y velocidad, especialmente útil en muestras con baja concentración de proteínas. La integración de estos análisis proteómicos con el desarrollo de modelos experimentales innovadores que simulan la migración temprana del parásito, también realizados durante esta Tesis Doctoral, permitió alcanzar el objetivo principal de la misma: identificar proteínas clave implicadas en el desarrollo temprano de F. hepatica en el hospedador, con la intención de proponer nuevas dianas vacunales frente a la fasciolosis. Para investigar las adaptaciones moleculares de F. hepatica durante su desarrollo temprano, se estableció un modelo in vivo en ratón de infección oral con las formas de resistencia del parásito (metacercarias). Los parásitos juveniles se recuperaron en dos etapas clave: a las 24 horas post-infección (p.i.) en la cavidad peritoneal, tras atravesar la barrera intestinal, y a los 8 días p.i. en el parénquima hepático, reflejando el inicio de la migración hepática. El perfil proteómico de las fracciones somática y tegumentaria del parásito en estos estadios permitió una caracterización detallada de los cambios dinámicos que experimenta el parásito al migrar en diferentes entornos del hospedador. Los datos revelaron importantes modificaciones en las vías metabólicas, incluida la transición progresiva desde la producción de energía aeróbica hacia mecanismos anaeróbicos, así como la regulación de la maquinaria proteolítica, esencial para la invasión tisular y la evasión del sistema inmunitario, reflejando las adaptaciones fisiológicas que el parásito debe afrontar durante estas fases de la infección. Así mismo, se desarrollaron sistemas de co-cultivo in vitro para estudiar las primeras etapas de la migración a nivel celular en un entorno controlado de laboratorio. Estos modelos fueron diseñados para replicar los ambientes que encuentra el parásito durante la invasión del hospedador, con el objetivo de profundizar en la investigación de las interacciones moleculares, y de reducir el uso de animales de experimentación. Los primeros co-cultivos de los juveniles recién desenquistados de F. hepatica (FhNEJ) con células murinas mesoteliales y estrelladas hepáticas, que representan respectivamente los entornos peritoneal y hepático, mostraron una interacción limitada, ya que los datos proteómicos tanto del parásito como de las células del hospedador revelaron pocos cambios tras la interacción. Esto motivó el desarrollo de un modelo de co-cultivo secuencial que simulase con mayor precisión la ruta natural de migración del parásito. En este modelo, los co-cultivos de FhNEJ con células epiteliales intestinales y, posteriormente, con células mesoteliales, revelaron adaptaciones proteómicas diferenciadas. El contacto previo con el epitelio intestinal desencadenó una respuesta específica y dependiente del tipo celular, ausente o atenuada en presencia de las células mesoteliales, donde los cambios proteómicos fueron más limitados o enmascarados. Los datos proteómicos obtenidos se integraron con información ómica previamente publicada en modelos complementarios para identificar candidatos vacunales en las etapas tempranas del desarrollo de F. hepatica. De este modo, las proteínas catepsina B3 (FhCB3), legumina 1 (FhLeg1) y serpina 1 (FhSrp1) fueron seleccionadas por su relevancia durante la migración inicial del parásito. El análisis in silico predijo su inmunogenicidad y propiedades estructurales, mientras que los ensayos de inmunofluorescencia confirmaron su localización en el tegumento del parásito. Para profundizar en la relevancia funcional de estos antígenos, se desarrolló una innovadora metodología de edición genética basada en CRISPR-Cas, que sienta las bases para futuros ensayos orientados a evaluar el potencial vacunal de diversas dianas parasitarias a travésde su estudio directo de su papel en la biología del parásito. En definitiva, esta Tesis Doctoral aporta nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo temprano de F. hepatica y su interacción con el hospedador. La integración de enfoques proteómicos, modelos experimentales y análisis bioinformáticos permitió identificar antígenos clave con potencial vacunal, abriendo nuevas vías para el control eficaz de la fasciolosis.; [EN] Fasciolosis is a parasitic disease caused primarily by the trematode Fasciola hepatica. There is a growing global concern about this pathology, both in human and animal health, as the parasite's ability to infect a wide variety of mammalian hosts, along with its adaptability to diverse climatic conditions, has favored its expansion to new regions, further driven by global warming and certain agricultural practices. Recognized by the World Health Organization as a Neglected Tropical Disease, fasciolosis affects approximately 17 million people, with more than 90 million at risk. It also causes significant economic losses in the livestock industry, primarily sheep and cattle, estimated at up to $3 billion annually, due to decreased productivity, mortality, and associated treatment costs. Treatment of fascioliasis continues to rely on the use of anthelmintic drugs. However, the increasing emergence of resistance compromises their efficacy, making vaccine development an urgent priority. Despite advances in our understanding of F. hepatica biology, the initial stages of parasite migration within the vertebrate (definitive) host—during which juvenile worms cross the intestinal barrier, move through the peritoneal cavity, and enter the liver—have been relatively poorly explored at the molecular level, despite representing key moments for the establishment of infection. In this context, a thorough understanding of parasite-host interactions at these early stages could lead to the identification of new vaccine candidates. Currently, cutting-edge omics technologies are significantly expanding molecular knowledge about F. hepatica, with proteomics being an essential link between its genome and the parasite's biology. Within the framework of this PhD thesis, this approach has been essential to identify the expression of parasite-specific proteins during the initial stages of infection in the definitive host. Two advanced mass spectrometry techniques based on data-independent acquisition (DIA) were employed: SWATH-MS (Sequential Window Acquisition of All Theoretical Mass Spectra), which allows the reproducible quantification of thousands of peptides, and diaPASEF (Parallel Accumulation–Serial Fragmentation combined with DIA), which offers greater sensitivity and speed, especially useful in samples with low protein concentrations. The integration of these proteomic analyses with the development of innovative experimental models that simulate early parasite migration, also conducted during this PhD thesis, allowed us to achieve the main objective of this thesis: to identify key proteins involved in the early development of F. hepatica in the host, with the aim of proposing new vaccine targets against fasciolosis. To investigate the molecular adaptations of F. hepatica during its early development, an in vivo mouse model of oral infection with resistant forms of the parasite (metacercariae) was established. Juvenile parasites were recovered at two key stages: 24 hours post-infection (p.i.) in the peritoneal cavity, after crossing the intestinal barrier, and 8 days p.i. in the liver parenchyma, reflecting the onset of liver migration. Proteomic profiling of the somatic and tegumentary fractions of the parasite at these stages allowed a detailed characterization of the dynamic changes the parasite undergoes as it migrates through different host environments. The data revealed significant modifications in metabolic pathways, including the progressive transition from aerobic to anaerobic energy production, as well as the regulation of the proteolytic machinery, essential for tissue invasion and immune system evasion, reflecting the physiological adaptations the parasite must undergo during these stages of infection. In vitro co-culture systems were also developed to study the early stages of migration at the cellular level in a controlled laboratory setting. These models were designed to replicate the environments encountered by the parasite during host invasion, with the aim of furthering the investigation of molecular interactions and reducing the use of experimental animals. Initial co-cultures of newly excysted juvenile F. hepatica (FhNEJ) with murine mesothelial or hepatic stellate cells, representing the peritoneal and hepatic environments, respectively, showed limited interaction, as proteomic data from both the parasite and host cells revealed few changes following interaction. This prompted the development of a sequential co-culture model that more accurately simulated the parasite's natural migration route. In this model, co-cultures of FhNEJ with intestinal epithelial cells and, subsequently, with mesothelial cells revealed distinct proteomic adaptations. Prior contact with the intestinal epithelium triggered a cell-type-specific response, which was absent or attenuated in the presence of mesothelial cells, where proteomic changes were more limited or masked. The proteomic data obtained were integrated with previously published omics information in complementary models to identify vaccine candidates in the early stages of F. hepatica development. Thus, the proteins cathepsin B3 (FhCB3), legumin 1 (FhLeg1), and serpin 1 (FhSrp1) were selected for their relevance during the initial migration of the parasite. In silico analysis predicted their immunogenicity and structural properties, while immunofluorescence assays confirmed their localization in the parasite tegument. To further investigate the functional relevance of these antigens, an innovative CRISPR-Cas-based gene editing methodology was developed, which lays the groundwork for future trials aimed at evaluating the vaccine potential of various parasitic targets by directly studying their role in parasite biology. Ultimately, this doctoral thesis provides new insights into the molecular mechanisms involved in the early development of F. hepatica and its interaction with the host. The integration of proteomic approaches, experimental models, and bioinformatics analyses has allowed us to identify key antigens with vaccine potential, opening new avenues for effective control of fascioliasis. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/169965 [ES] Dentro de la superfamilia de las quinesinas, un grupo de proteínas motoras que se desplazan a través de los microtúbulos, se encuentran las quinesinas mitóticas, presentes en todas las células eucariotas. Entre ellas, destaca la quinesina 5 humana, también conocida como Eg5. Esta proteína motora es fundamental para el ensamblaje y mantenimiento del huso mitótico bipolar durante la prometafase. Cuando se inhibe, la mitosis celular se detiene, lo que provoca la muerte celular. Dado que no se conocen otras funciones de Eg5, esta proteína constituye una diana prometedora para el desarrollo de nuevos fármacos antimitóticos, los cuales evitarían la neurotoxicidad asociada a los que actualmente se utilizan en clínica. En este trabajo se ha llevado a cabo la síntesis y caracterización de 1H-1,2,3-triazoles trisustituidos en las posiciones 1, 4 y 5. Estos triazoles han sido diseñados para interactuar con el sitio L5 de Eg5. Además, se han obtenido sus intermedios de síntesis: azidas bencílicas y las chalconas y heterochalconas; dímeros de heterochalconas con estructura de ciclobutano; enaminas secundarias formadas en la síntesis de triazoles; y compuestos de adición conjugada a las heterochalconas. También se ha investigado la reactividad y el mecanismo de reacción de diversas heterochalconas frente a la cicloadición [2+2] fotoinducida. La potencial actividad antimitótica de los compuestos obtenidos se ha evaluado mediante la determinación de la citotoxicidad de 31 triazoles, 3 enaminas, 3 ciclobutanos, 17 heterochalconas y 1 compuesto de adición conjugada a heterochalcona frente a las líneas tumorales de mieloma MM.1S y RPMI8226. Los compuestos que mostraron una mayor citotoxicidad fueron las heterochalconas, especialmente aquellas con anillos de piridina y, en particular, cuando el fragmento benzoilo contiene átomos de flúor. Asimismo, dado que las quinesinas también se encuentran en parásitos, se ha evaluado la actividad tripanocida de 30 triazoles, 3 enaminas, 3 ciclobutanos, 17 heterochalconas y 1 compuesto de adición conjugada a heterochalcona sobre epimastigotes y amastigotes de Trypanosoma cruzi, así como su citotoxicidad sobre células Vero, hospedadoras de amastigotes. En este caso, los triazoles demostraron una mayor potencia tripanocida y selectividad, destacando especialmente los triazoles que contienen un fragmento indolilo. Finalmente, Un análisis preliminar de la selectividad de los compuestos mostró resultados prometedores, ya que aquellos con mayor citotoxicidad fueron selectivos hacia las células tumorales en comparación con las no tumorales.; [EN] Within the kinesin superfamily, a group of motor proteins that move along microtubules, there is a subgroup known as mitotic kinesins, which are found in all eukaryotic cells. Among them, human kinesin-5, also referred to as Eg5, plays a particularly important role. This motor protein is essential for the assembly and maintenance of the bipolar mitotic spindle during prometaphase. Inhibiting Eg5 disrupts cell division, ultimately leading to cell death. Since no other cellular functions have been attributed to Eg5, it represents a promising target for the development of new antimitotic drugs that could avoid the neurotoxicity often associated with current antimitotic treatments. In this study, a series of 1H-1,2,3-triazoles substituted at positions 1, 4, and 5 were synthesized and characterized. These compounds were specifically designed to interact with the L5 binding site of Eg5. Alongside the triazoles, their synthetic intermediates, benzyl azides, chalcones, and heterochalcones, were also prepared. Cyclobutane-structured heterochalcone dimers, secondary enamines formed during triazole synthesis, and conjugate addition products to heterochalcones were also obtained. Furthermore, the reactivity and reaction mechanisms of [2+2] photoinduced cycloaddition of several heterochalcones were also studied. To assess the potential antimitotic activity of these compounds, cytotoxicity tests were conducted on multiple series: 31 triazoles, 3 enamines, 3 cyclobutanes, 17 heterochalcones, and 1 conjugate addition product to heterochalcone. These were tested against the MM.1S and RPMI8226 multiple myeloma cell lines. Heterochalcones showed the highest cytotoxicity, particularly those containing pyridine rings and, more notably, those with fluorine atoms on the benzoyl moiety. Given that kinesins are also present in parasites, the trypanocidal activity of 30 triazoles, 3 enamines, 3 cyclobutanes, 17 heterochalcones, and 1 conjugate addition compound to heterochalcone was evaluated against both epimastigote and amastigote forms of Trypanosoma cruzi, along with their cytotoxicity on Vero cells (the host cells of amastigotes). In this context, the triazoles displayed stronger trypanocidal activity and better selectivity, with indole-containing triazoles standing out. Lastly, a preliminary analysis of compound selectivity yielded promising results, with the most cytotoxic compounds showing a higher selectivity toward tumor cells compared to non-tumor cells. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/169581 [ES] El microambiente tumoral (TME) desempeña un papel crucial en la progresión del cáncer y la respuesta a la inmunoterapia. Los tumores pueden clasificarse como «hot», caracterizados por una alta infiltración de células T CD8+ y una buena respuesta a la inmunoterapia, o «cold», con baja infiltración inmunitaria, un perfil inmunosupresor y resistencia al tratamiento. Niveles elevados de endoglina (CD105), un correceptor del factor de crecimiento transformante ß (TGF-ß) implicado en la angiogénesis, se han asociado con un mal pronóstico en varios tipos de cáncer, lo que la convierte en posible biomarcador para distinguir los tipos de tumores, algo esencial para la terapia personalizada. Sin embargo, su papel en la determinación del TME sigue sin estar claro. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la sobreexpresión de endoglina sobre la determinación del TME y el efecto de este en la respuesta a la inmunoterapia. Además, analizamos el efecto de un anticuerpo anti-endoglina como posible modulador del TME y la respuesta a la inmunoterapia. Se utilizaron ratones transgénicos que sobreexpresan endoglina (ENG+) en distintos modelos murinos de adenocarcinoma de pulmón: un modelo subcutáneo, un modelo basado en la administración intravenosa de células tumorales y un modelo inducido por el carcinógeno uretano. Se estudió la composición del microambiente a través de análisis histológicos y RT-PCR. Además, se clasificaron muestras de adenocarcinoma pulmonar humano en función de sus perfiles vascular e inmunitario para evaluar la asociación entre la expresión de endoglina y las características del TME. Los tumores con alta expresión de endoglina mostraron una maduración vascular alterada, un aumento de la hipoxia y una reducción de la infiltración de células T CD8+. También se observó un aumento significativo de macrófagos M2, en consonancia con un microambiente tumoral inmunosupresor. En muestras de adenocarcinoma de pulmón humano, los niveles más altos de endoglina se correlacionaron con un TME «cold». El tratamiento con anti-PD-1 resulta en un incremento de CD8, acompañado de un efecto inmunosupresor compensatorio. La terapia anti-endoglina (TRC105) es capaz de revertir el efecto inmunosupresor de endoglina, aumentando la infiltración de linfocitos CD8+, pero no logra revertir el aumento de poblaciones protumorales. Sin embargo, el tratamiento combinado de TRC105 e inmunoterapia bloquea los efectos que ejerce el anti-PD1 en monoterapia sobre la infiltración de linfocitos T CD8+. Por tanto, la sobreexpresión de endoglina se asocia con un TME inmunosupresor, alterando la respuesta a la inmunoterapia. Además, endoglina resulta crítica para que se produzca una adecuada respuesta a la terapia anti-PD1. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/169551 [ES] Introducción: El uso cada vez más generalizado de los diversos dispositivos móviles (smartphone, tablets, etc.) y la facilidad de acceso a las aplicaciones relacionadas con la nutrición y la actividad física, pueden deparar a las intervenciones que utilizan la tecnología como refuerzo de la atención habitual, que ya ha demostrado su efectividad, un gran potencial para mejorar la salud de la población, sin incrementar el tiempo consumido a los profesionales de la salud. Objetivos: los objetivos son evaluar la eficacia de una intervención m-Health multicomponente (GI), que combina la aplicación para móvil Evident 3 y una pulsera inteligente, en comparación con la intervención breve (GC) en la mejora de los factores de riesgo cardiovascular, rigidez arterial y envejecimiento vascular a corto plazo (3 meses) y a largo plazo (12 meses) en adultos sedentarios con IMC entre 27-40. Además, se analizará la diferencia por sexo. Métodos: Ensayo clínico aleatorio de dos grupos paralelos, multicéntrico y doble ciego realizado en el ámbito de la Atención Primaria de Salud. Se incluyeron 650 sujetos con edades comprendidas entre 20-60 años, randomizados en GC que recibía el consejo habitual sobre dieta y ejercicio y en GI que añadido al consejo se le entregaba durante 3 meses una smartband y un móvil con una app que media la actividad física y evalúa la ingesta alimentaria autorreportada, devolviendo al sujeto recomendaciones para mejorar sus objetivos diarios. Se realizaron 2 visitas de seguimiento adicionales a la visita inicial a ambos grupos: una a los 3 meses y otra a los 12 meses donde se recogieron todas las medidas de resultados. Resultados y conclusiones: 1. La intervención m-Health multicomponente (GI), que combina la aplicación para móvil Evident 3 y una pulsera inteligente, en comparación con la intervención breve (GC) produjo una reducción significativa del peso, IMC, perímetro de la cintura y ácido úrico a corto plazo (3 meses) y a largo plazo (12 meses) en adultos sedentario con sobrepeso grado 2 u obesidad. 2. La intervención m-Health multicomponente (GI), que combina la aplicación para móvil Evident 3 y una pulsera inteligente, en comparación con la intervención breve (GC) no produjo cambios significativos en los marcadores de la rigidez arterial y de la presión arterial central a corto plazo (3 meses) y a largo plazo (12 meses) en adultos sedentarios con sobrepeso grado 2 u obesidad. Únicamente se encontró un mayor descenso en el GI a los 3 meses en la Velocidad de la Onda del Pulso brazo-tobillo, pero la tendencia no se mantuvo a los 12 meses. 3. Al analizar la diferencia por sexo de la eficacia de una intervención m-Health multicomponente, en el grupo de mujeres encontramos una reducción significativa del peso, IMC, perímetro de la cintura y ácido úrico a corto plazo (3 meses) y a largo plazo (12 meses), sin cambios en los marcadores de la rigidez arterial. En el grupo de los hombres, la intervención m-Health multicomponente (GI), produjo una reducción significativa de los triglicéridos a los 12 meses. En las medidas de rigidez arterial se produjo un mayor descenso del índice de aumento Central 75 en el grupo de intervención, respecto al control a los 3 y 12 meses 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/167312 [EN] the main objective of this thesis is to expand our knowledge of host-parasite relationships during the early stages of fasciolosis, with a particular focus on the potential interplay between FhNEJ and the host's fibrinolytic system and the role of this interaction in the migration of these parasites through the host intestine. This knowledge may inform the identification of parasitic molecules that can be targeted for therapeutic or immunological interventions, ultimately leading to the development of novel strategies that prevent parasite maturation and block disease transmission within affected populations.; [ES] el objetivo principal de esta tesis es ampliar el conocimiento sobre las relaciones parásito-hospedador que se establecen durante las etapas iniciales de la fasciolosis, con un enfoque particular en la posible interacción entre los FhNEJ y el sistema fibrinolítico del hospedador, así como el papel que esta interacción podría desempeñar en la migración de estos parásitos a través del intestino de su hospedador definitivo. Este conocimiento podría llevar a la identificación de moléculas parasitarias susceptibles de ser objeto de intervenciones terapéuticas o inmunológicas, lo que contribuiría al desarrollo de nuevas estrategias destinadas a impedir la maduración del parásito y bloquear la transmisión de la enfermedad entre las poblaciones afectadas.; [CA] l’objectiu principal d’aquesta tesi és ampliar el coneixement sobre les interaccions hoste-paràsit durant les etapes inicials de la fasciolosi, posant èmfasi en la possible interacció entre les FhNEJ i el sistema fibrinolític, així com el paper que aquesta interacció podria desenvolupar en la migració d’aquests paràsits a través de l’intestí del seu hoste definitiu. Aquest coneixement podria facilitar la identificació de molècules parasitàries susceptibles de ser objecte d’intervencions terapèutiques o immunològiques, contribuint així al desenvolupament de noves estratègies que impedeixin la maduració del paràsit i interrompin la transmissió de la malaltia entre les poblacions afectades. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/166640 [ES] Antecedentes: La microbiota intestinal y sus subproductos son cada vez más reconocidos por tener un papel decisivo en las enfermedades cardiovasculares. Investigaciones recientes destacan el papel potencial de las variaciones específicas según el sexo en estas patologías, demostrándose que el microbioma intestinal difiere entre los sexos en pacientes con factores de riesgo cardiovascular. Este estudio tiene como objetivos analizar la relación entre la microbiota intestinal y el envejecimiento vascular precoz (EVA), así como examinar las diferencias entre mujeres y hombres en la relación entre la microbiota intestinal y las medidas de rigidez arterial. Métodos: Se desarrolló un estudio observacional de casos y controles en Salamanca (España) en el que se reclutaron 180 sujetos (122 mujeres, 58 hombres) con edades entre 45 y 74 años. El EVA y la rigidez arterial se definieron por la presencia de al menos uno de los siguientes parámetros: velocidad de onda de pulso carótida-femoral (cf-PWV) superior a 12 m/s, índice vascular cardio-tobillo (CAVI) superior a 9, o velocidad de onda de pulso brazo-tobillo (ba-PWV) superior a 17.5 m/s, o por encima del percentil 90 de la población de referencia. Los sujetos que no cumplían estos criterios fueron considerados con envejecimiento vascular normal (NVA) o sin rigidez arterial. La cf-PWV se midió mediante el sistema SphygmoCor; CAVI y ba-PWV se determinaron mediante el dispositivo Vasera 2000. La composición del microbioma intestinal en muestras fecales se determinó mediante secuenciación Illumina de ARNr 16S. Resultados: La edad media fue de 64,4 ± 6,9 años en el grupo EVA (n = 81) y 60,4 ± 7,6 años en NVA (n = 99) (p < 0,01). Las mujeres representaron el 41% en el grupo EVA y el 53% en NVA. No hubo diferencias en la composición general de la microbiota intestinal entre los grupos EVA y NVA al evaluar la proporción Firmicutes/Bacteriodetes, diversidad alfa (Índice de Shannon) y diversidad beta (Bray-Curtis). Sin embargo, los géneros Bilophila, Faecalibacterium sp. UBA1819 y Phocea estaban aumentados en el grupo EVA, mientras que Cedecea, Lactococcus, Pseudomonas, Succiniclasticum y Dielma se encontraron en menor abundancia. En el análisis de regresión logística, Bilophila (OR: 1,71, IC 95%: 1,12-2,6, p = 0,013) mantuvo significación estadística. Al analizar las diferencias por sexo, encontramos que las mujeres tienen un microbioma más diverso que los hombres (Shannon, p < 0.05) y existe una diferencia significativa en la composición de la microbiota intestinal entre sexos (Bray-Curtis, p < 0.01). Dorea, Roseburia y Agathobacter, todos ellos productores de ácidos grasos de cadena corta, fueron más abundantes en la microbiota de las mujeres (valores logarítmicos > 1, valor p y FDR < 0.05). Además, Blautia fue más abundante en mujeres cuando solo se consideraron los sujetos con rigidez arterial. De acuerdo con la regresión logística, Roseburia se asoció negativamente con la rigidez arterial en hombres, mientras que Bifidobacterium y Subdoligranulum se relacionaron positivamente con la rigidez arterial. Conclusiones: En la población española estudiada, el envejecimiento vascular precoz está positivamente asociado con la abundancia en la microbiota intestinal del género Bilophila, sin encontrarse relación entre la abundancia de filos y las medidas de diversidad. Adicionalmente, las mujeres presentaron mayor diversidad del microbioma y géneros potencialmente protectores, y el género del huésped determina la influencia de las mismas bacterias en la rigidez arterial. Estos hallazgos subrayan la importancia de considerar las diferencias por sexo al estudiar la relación entre microbiota intestinal y salud cardiovascular.; [EN] Background: Gut microbiota and its byproducts are increasingly recognized as having a decisive role in cardiovascular diseases. Recent research highlights the potential role of sex-specific variations in these pathologies, demonstrating that the intestinal microbiome differs between sexes in patients with cardiovascular risk factors. This study aims to analyze the relationship between gut microbiota and early vascular aging (EVA) and examine differences between women and men in the relationship between gut microbiota and measures of arterial stiffness. Methods: A cross-sectional study was conducted in Salamanca (Spain), recruiting 180 subjects (122 women, 58 men) aged between 45 and 74 years. EVA and arterial stiffness were defined by the presence of at least one of the following parameters: carotid-femoral pulse wave velocity (cf-PWV) above 12 mm/s, cardio-ankle vascular index (CAVI) above nine, or brachial-ankle pulse wave velocity (ba- PWV) above 17.5 m/s, or above the 90th percentile of the reference population. Subjects who did not meet these criteria were considered to have normal vascular aging (NVA) or no arterial stiffness. The cf-PWV was measured using the SphygmoCor system; CAVI and ba-PWV were determined using the Vasera 2000 device. Gut microbiome composition in fecal samples was determined by Illumina sequencing of 16S rRNA. Results: The mean age was 64.4 ± 6.9 years in the EVA group and 60.4 ± 7.6 years (n=81) in the NVA group (n=99) (p < 0.01). Women represented 41% in the EVA group and 53% in the NVA group. There were no differences in the overall composition of gut microbiota between the EVA and NVA groups when evaluating the Firmicutes/Bacteriodetes ratio, alpha diversity (Shannon Index), and beta diversity (Bray-Curtis). However, the genera Bilophila, Faecalibacterium sp. UBA1819, and Phocea were increased in the EVA group, while Cedecea, Lactococcus, Pseudomonas, Succiniclasticum, and Dielma were found in lower abundance. In the logistic regression analysis, Bilophila (OR: 1.71, 95% CI: 1.12- 2.6, p = 0.013) maintained statistical significance. When analyzing sex differences, we found that women have a more diverse microbiome than men (Shannon, p < 0.05) and there is a significant difference in gut microbiota composition between sexes (Bray-Curtis, p < 0.01). Dorea, Roseburia, and Agathobacter, all short-chain fazy acid producers, were more abundant in women's microbiota (log values > 1, p-value and FDR < 0.05). Additionally, Blautia was more abundant in women when only subjects with arterial stiffness were considered. According to logistic regression, Roseburia was negatively associated with arterial stiffness in men, while Bifidobacterium and Subdoligranulum were positively related to arterial stiffness. Conclusions: In the Spanish population studied, early vascular aging is positively associated with the abundance of the genus Bilophila in the gut microbiota, with no relationship found between phyla abundance and diversity measures. Additionally, women presented greater microbiome diversity and potentially protective genera, and host sex determines the influence of the same bacteria on arterial stiffness. These findings underscore the importance of considering sex differences when studying the relationship between gut microbiota and cardiovascular health. 2025-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/165814 [ES]Los helmintos parásitos constituyen uno de los grupos de agentes infecciosos más comunes, tanto de humanos como de animales. Estos parásitos llevan coevolucionando con sus hospedadores miles de años, lo que ha supuesto la aparición de interacciones finamente reguladas y equilibradas entre ambos organismos. Entre ellas destacan las diversas estrategias que los parásitos han desarrollado para afrontar y evadir las respuestas de sus hospedadores y adaptar o modificar la fisiología de estos a sus propias necesidades. Una de estas estrategias es la manipulación que hacen del sistema hemostático, mecanismo responsable de mantener la integridad vascular en los vertebrados mediante la formación de coágulos sanguíneos (sistema de la coagulación) y la posterior disolución de los mismos (sistema fibrinolítico). La información existente en este campo de estudio es cuantiosa y diversa y se encuentra dispersa en la literatura científica. Por ello, el primer objetivo de la Tesis Doctoral fue realizar una revisión de alcance para revisar, sintetizar y unificar esta información, actualizar conceptos e identificar vacíos de conocimiento. Los resultados revelaron un número considerable de especies de helmintos parásitos con capacidad para interaccionar con el sistema hemostático en diferentes estadios evolutivos. Las interacciones que llevaron a cabo resultaron, principalmente, en la inhibición de la coagulación y la activación de la fibrinolisis. Se identificó un número elevado de proteínas parasitarias como responsables de interaccionar con un gran número de componentes del sistema hemostático, las cuales presentaron cierta homología con los moduladores fisiológicos de este sistema en el hospedador. Las distintas especies mostraron un patrón común de interacción, lo que sugiere procesos de convergencia evolutiva que podrían haberse conservado al ser beneficiosos para la nutrición, el establecimiento y la supervivencia del parásito en el hospedador. Con el objetivo de estudiar experimentalmente este tipo de interacciones, se empleó la larva infectiva de Ascaris suum, la cual realiza una extensa ruta migratoria por diferentes tejidos de su hospedador a través de la circulación sanguínea del mismo. Este helminto es el parásito intestinal más prevalente en cerdos domésticos de todo el mundo, presenta potencial zoonótico y se encuentra muy próximo filogenéticamente a A. lumbricoides, especie que afecta al ser humano con más de 800 millones de casos en el mundo. Los resultados mostraron que la larva infectiva de A. suum sigue el patrón general de interacción con el sistema hemostático observado en la revisión de alcance, pues se demuestra su capacidad para inhibir componentes del sistema de la coagulación de su hospedador, así como para activar su ruta fibrinolítica. En relación con las moléculas implicadas en estos procesos, se identificaron tres y doce proteínas del parásito, respectivamente. Esta manipulación del sistema hemostático podría conferirle a dicha larva beneficios en términos de migración por los tejidos de su hospedador y, por tanto, de establecimiento y supervivencia en él. Puesto que el estudio de las relaciones parásito-hospedador se ha postulado como uno de los pilares fundamentales para el desarrollo de nuevas herramientas de control contra las helmintiasis, y debido a la importancia biológica y conservación evolutiva de este mecanismo de interacción parasitario, la información aportada por la presente Tesis Doctoral podría contribuir al futuro diseño de dichas herramientas. 2023-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/161142 [SPA]Las células madre mesenquimales (MSC) poseen un gran potencial terapéutico debido a sus diversas propiedades biológicas únicas, entre las que destacan su capacidad inmunomoduladora y su capacidad para modular la angiogénesis. Se caracterizan por expresar CD`Wd (endoglina), una glicoproteína implicada en procesos fisiopatológicos tales como la angiogénesis, la remodelación vascular y la regulación de la inflamación. Sin embargo, no se ha investigado previamente la función específica de endoglina en las MSC. Por otra parte, la deficiencia de endoglina causa una enfermedad rara autosómica dominante denominada Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT). Las principales manifestaciones clínicas de la HHT son hemorragias nasales intensas y la presencia de telangiectasias y malformaciones arteriovenosas (MAV). En este sentido, resultados previos de nuestro laboratorio muestran que el tratamiento localizado con MSC de donantes sanos en un modelo murino de la enfermedad de HHT, reduce la aparición y la gravedad de las MAV. A causa de todo lo mencionado, nos planteamos que la modificación de la expresión de endoglina podría alterar la función de las MSC. Si esta hipótesis es correcta, los pacientes con HHT con mutaciones en el gen de endoglina podrían presentar MSC disfuncionales, lo que podría explicar algunos aspectos fisiopatológicos de la enfermedad. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es examinar si la modificación de la expresión de endoglina altera las propiedades biológicas de las MSC. Nuestros resultados demuestran que la deficiencia de endoglina altera la capacidad inmunomoduladora de las MSC, puesto que modifica su efecto sobre la proliferación, migración y polarización de células inmunes. Asimismo, parece modificar el efecto proangiogénico de las MSC, volviéndolas antiangiogénicas. 2024-10-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/159624 [ES]Considerando la interconexión entre la diabetes mellitus tipo 1 y los problemas cardiovasculares, donde destaca la alteración del sistema serotonérgico en ambas patologías, el objeWvo general de esta tesis doctoral se centra en estudiar si la modulación del receptor 5-HT2 muestra efectos beneficiosos sobre las alteraciones metabólicas y cardiovasculares en diabetes experimental. En consecuencia, como objeWvos específicos se plantean: - Estudiar si la diabetes induce cambios fisiopatológicos a nivel metabólico y cardiovascular, sobre la función renal y la agregación plaquetaria, estableciendo el efecto que puede ejercer el bloqueo crónico de los receptores 5-HT2 sobre dichas alteraciones. - Determinar en animales diabéticos si el bloqueo crónico del receptor 5-HT2 con sarpogrelato modifica la capacidad de 5-HT de modular la neurotransmisión simpática vascular. - Establecer, en riñón autoperfundido, si el sistema serotonérgico altera la actividad simpática en el lecho vascular de ratas diabéticas, definiendo el/los tipos/s y o subtipo/s de receptores, así como los posibles mediadores vasculares indirectos implicados en dichas acciones. - Analizar el efecto del bloqueo crónico de los receptores 5-HT2 sobre la actividad simpática renal y su repercusión en el perfil serotonérgico implicado en la modulación del flujo simpático renal en animales diabéticos 2024-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/159114 [ES] La proteína tirosina fosfatasa tipo 13 no receptora (PTPN13) es una enzima intracelular con una estructura modular que puede funcionar como oncogén o gen supresor de tumores. PTPN13 presenta varios dominios, incluyendo KIND, FERM, PDZ y PTP. Se ha demostrado que PTPN13 interactúa con β catenina en células hematopoyéticas para regular la quiescencia de las células madre hematopoyéticas. En pacientes con síndromes de insuficiencia de médula ósea y leucemia linfoide aguda se han descubierto mutaciones en el gen PTPN13, como p.R1838Q, p.W1274C y p.S1004. Se investigan los efectos celulares de estas mutaciones en la línea germinal que afectan a PTPN13 en pacientes con LLA y síndromes de insuficiencia de médula ósea hereditaria. Se analizan las mutaciones en el gen PTPN13 y su efecto en la función de la proteína en células hematopoyéticas. Se encontró que las mutaciones disminuyen la estabilidad de PTPN13, lo que afecta los niveles de β catenina y dificulta la diferenciación eritroide y megacariocítica en células K562. En células del linaje linfoide, las mutaciones alteran la diferenciación linfoide disminuyendo o aumentando la expresión de ciertos marcadores. El silenciamiento de PTPN13 y β catenina afecta la diferenciación linfoide y la expresión de marcadores específicos, indicando su importancia en este proceso. Además, se observó que la reducción en la expresión de proteínas asociadas con la vía de señalización del BCR podría estar relacionada con el silenciamiento de PTPN13. Estos hallazgos sugieren que las mutaciones en PTPN13 pueden tener un papel patogénico en trastornos hematológicos, especialmente en el desarrollo de IBMFS y LLA. 2024-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/159109 [ES] El colangiocarcinoma (CCA) es el segundo tipo de tumor hepático primario más frecuente, después del carcinoma hepatocelular (HCC). Una de las mayores dificultades con las que tropieza la oncología actual es la falta de respuesta de muchos tumores a los agentes farmacológicos utilizados para su tratamiento debido a los cambios que aparecen durante la oncogénesis y el tratamiento en el fenotipo de las células tumorales. Precisamente la quimiorresistencia, junto con que frecuentemente el CCA se diagnostica en estadíos avanzados, cuando la cirugía ya no es viable, son factores determinantes del mal pronóstico de estos pacientes. Entre las causas de la falta de respuesta del CCA a la quimioterapia se encuentra la pérdida de función de las proteínas transportadoras de la membrana plasmática que se requiere para que los fármacos alcancen sus dianas intracelulares. El conjunto de transportadores que expresa la célula en un momento dado se denomina transportoma y determina las sustancias que la célula puede captar o expulsar en ese momento. El transportoma es una característica dinámica que permite a la célula adaptarse a las circunstancias cambiantes como es la presión farmacológica que supone el tratamiento de quimioterapia contra el cáncer. Así pues, la célula tumoral puede escapar a la quimioterapia reduciendo la expresión de transportadores implicados en la captación de fármacos o a través de un procesamiento anormal del pre-ARNm durante el proceso de splicing llevado a cabo por el espliceosoma, generando proteínas con pérdida parcial o total de la función transportadora. Teniendo en cuenta estos antecedentes, nos planteamos como objetivo global de esta Tesis Doctoral identificar mediante estudios in silico y con modelos experimentales in vitro las alteraciones en los elementos de la maquinaria de maduración del pre-ARNm y el patrón de splicing alternativo de distintos transportadores implicados en la captación de fármacos, y establecer una relación entre estos cambios y el fenotipo de resistencia a múltiples fármacos del CCA. Así, hemos detectado cambios en la expresión de genes que intervienen en la maquinaria de splicing, como SNRPB, SRSF4, ESRP1 y MBNL1 en distintas líneas celulares resistentes en comparación a las células controles. Además, en modelos 3D derivados de líneas de CCA, los cuales, presentan una mayor resistencia a distintos agentes antitumorales, el patrón de expresión de variantes de splicing de transportadores de fármacos presenta marcadas diferencias, lo que plantea la posibilidad de utilizar estos modelos, como herramientas complementarias en el estudio de la quimiorresistencia y el splicing. Por otro lado, se ha llevado a cabo un análisis in silico, utilizando los datos de la base de datos TCGA y un estudio experimental mediante TLDAs utilizando muestras de pacientes con CCA, en el que hemos detectado diferencias en el patrón de expresión de distintos genes de splicing entre el CCA y colangiocitos sanos, lo que sugiere que durante la carcinogénesis se altera la regulación del proceso de splicing en el CCA, favoreciendo la aparición de splicing aberrante en las células de este tumor. Además, en el estudio de supervivencia global estimado por el método de Kaplan-Meier y el análisis de regresión Cox, hemos determinado que el gen SRSF10, miembro de la familia de factores reguladores del splicing SR, presenta niveles de expresión altos en CCA, lo que se asocia con una expectativa de supervivencia global menor para estos pacientes. Por ello, se propone la detección de la expresión de SRSF10 como un biomarcador pronóstico en este tipo de cáncer, cuya utilidad real debe ser validada en estudios posteriores enfocados a tal fin. Finalmente, también se ha estudiado el papel del factor de splicing PCBP2 en CCA. Así, PCBP2 no parece jugar un papel importante en la quimiorresistencia del CCA, pero está implicado en la potenciación de otras características de malignidad tumoral como son la capacidad de migración celular y la activación de la proliferación de las células de este tipo de tumor mediante la regulación de la expresión de los genes MEX3A, NRIP1 y NRP2 y la alteración del patrón de splicing alternativo de MAP4K4 y MYLK. Por ello, PCBP2 podría ser considerado una diana farmacológica a la hora de generar nuevas dianas terapéuticas en el tratamiento del CCA. 2024-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/157592 [ES] En la actualidad, se desconoce la incidencia y las características de los pacientes que son diagnosticados con colangiocarcinoma (CCA) en el área de Salamanca que, además de esta provincia, incluye las provincias de Zamora y Ávila. El Complejo Asistencial Universitario de Salamanca (CAUSA) es el hospital de referencia para los pacientes con este tipo de tumor biliar que cumplen los criterios para ser sometidos a una resección quirúrgica. A nivel mundial, se estima que sólo un 20-25% de los pacientes con CCA se diagnostican en etapas iniciales, cuando aún pueden recibir un tratamiento quirúrgico potencialmente curativo. El hecho de que este tumor tenga una evolución silenciosa en las primeras etapas, junto con la falta de biomarcadores precisos para un diagnóstico precoz y que no estén bien identificados todos los factores de riesgo, justifica que el pronóstico de los pacientes con este cáncer biliar sea malo. En base a estos antecedentes se plantearon los siguientes objetivos de esta Tesis Doctoral: Objetivo 1º: Identificar los casos de pacientes con CCA atendidos en el CAUSA en el periodo 2015-2020, en comparación con otros tumores hepáticos. Objetivo 2º: Realizar un estudio descriptivo de las características de los pacientes con CCA que fueron candidatos a cirugía en el área de Salamanca en el periodo comprendido entre 2015 y 2020. Objetivo 3º: Realizar un estudio metabolómico en muestras de suero de pacientes con iCCA, HCC y sujetos control para identificar metabolitos con niveles alterados en iCCA y HCC con potencial utilidad para un diagnóstico temprano y para discriminar entre los dos tipos de tumores hepáticos. 2023-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/157519 [ES] La fasciolosis es una zoonosis parasitaria causada por vermes trematodos del género Fasciola, principalmente por las especies F. hepatica y F. gigantica. Está considerada como la enfermedad de transmisión alimentaria con la distribución geográfica más amplia conocida, con casos documentados en los 5 continentes. El carácter ubicuo de la enfermedad es, en parte, debido a la capacidad de los vermes para establecerse sobre una amplia variedad de hospedadores, tanto intermediarios como definitivos. La fasciolosis causa anualmente pérdidas millonarias a la industria ganadera en forma de muertes de cabezas de ganado o reducción en la productividad de derivados animales (carne, leche, lana, etc.). Además, los costes indirectos como consecuencia del tratamiento farmacológico o la disminución de la fertilidad como resultado de la infección incrementan aún más la cifra. Por otra parte, aunque los hospedadores más habituales del parásito se identifican con mamíferos rumiantes, el ser humano también puede actuar como hospedador definitivo, por lo que la fasciolosis puede suponer un problema de salud pública, con varias regiones endémicas en todo el mundo. El control de la enfermedad resulta complicado por la naturaleza inespecífica de los signos y síntomas clínicos, la variabilidad de los mismos y la escasez de alternativas terapéuticas. Además, el tratamiento farmacológico presenta problemas como la persistencia de los fármacos en los tejidos del hospedador, lo que dificulta su aplicación en animales destinados al consumo, la contaminación ambiental, y la aparición de resistencias frente a los principales antihelmínticos conocidos, lo que puede desembocar en la ineficacia del tratamiento. La fasciolosis ha sido designada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como enfermedad abordable mediante la perspectiva One Health. Según este enfoque, el tratamiento eficaz de la enfermedad a nivel humano, veterinario o ambiental redundaría positivamente en los demás niveles, siendo requisito imprescindible aumentar el conocimiento sobre las interacciones que se establecen a nivel molecular entre parásito y hospedador, especialmente en las fases tempranas de la infección. En este sentido, la propuesta de nuevos modelos de laboratorio que permitan replicar el contacto y la relación entre ambos organismos durante estas fases, y su estudio mediante tecnologías -ómicas, indispensables para identificar las moléculas que rigen dichas interacciones, supondrían herramientas de gran utilidad para desentrañar estos importantes mecanismos. En la presente Tesis Doctoral, se llevó a cabo la puesta a punto de dos modelos de interacción parásito-hospedador que buscan replicar las condiciones de la infección temprana en la fasciolosis, la cual se produce tras la ingesta de las formas de resistencia del parásito, denominadas metacercarias, que liberan en el intestino delgado del hospedador los juveniles recién excistados (NEJ): - El primer modelo reproduce el primer contacto entre los NEJ y el intestino de su hospedador definitivo, representado por un cultivo primario de células epiteliales intestinales de ratón (MPSIEC), mediante un abordaje in vitro. Para ello, los NEJ previamente excistados se pusieron en contacto con un cultivo en placa de MPSIEC, y tras un tiempo de contacto comprendido entre las 3 y las 24 horas se separaron para analizar los cambios a nivel molecular en ambos organismos. - El segundo modelo recurre a una aproximación ex vivo con el fin de recrear el paso de los NEJ a través de la pared intestinal de su hospedador. En dicho modelo, se obtuvieron fragmentos de intestino delgado procedentes de ratones de laboratorio, en cuyo interior se introdujeron los NEJ previamente excistados. Pasadas dos horas y media, los NEJ que lograron atravesar el intestino se recolectaron y analizaron. La caracterización molecular de los cambios en parásito y hospedador tras su interacción se realizó mediante técnicas proteómicas y transcriptómicas. En concreto, el perfil de expresión diferencial a nivel de proteína en ambos organismos se evaluó mediante las metodologías iTRAQ (Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation) y SWATH-MS (Sequential Window Acquisition of All Theoretical Mass Spectra), las cuales hacen uso de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada a espectrometría de masas (MS) para la determinación del perfil proteómico de las muestras estimuladas y no estimuladas. Por su parte, los estudios transcriptómicos se realizaron mediante secuenciación de ARN (RNA-Seq) y su posterior mapeo sobre los correspondientes genomas de referencia. La utilización de estas técnicas permitió identificar un alto número de proteínas y transcritos cuyos niveles de expresión en muestras estimuladas se modificaban significativamente respecto a las no estimuladas. En los NEJ, estos se correspondieron con procesos biológicos importantes para la supervivencia del parásito, tales como la proteolisis y su regulación, la respuesta al estrés oxidativo, el metabolismo energético y el crecimiento o los mecanismos de evasión inmune, mientras que, en las MPSIEC, las proteínas y genes diferencialmente expresados se relacionaron principalmente con procesos de transporte intra y extracelular, la modulación de la respuesta inmune o el control de la expresión génica, además de incluir un elevado número de pseudogenes. El análisis e interpretación de los resultados de este trabajo proporcionan una mejor comprensión de la interacción parásito-hospedador a nivel temprano en la fasciolosis, y señalan una serie de antígenos importantes para la misma que podrían permitir la identificación de nuevas dianas terapéuticas y la formulación de nuevas vacunas, con el fin de lograr un control eficaz de la enfermedad en el futuro. 2023-01-01T00:00:00Z