http://hdl.handle.net/10366/4612 2026-09-16T12:34:55Z http://hdl.handle.net/10366/172664 [ES]El establecimiento del sitio de división en Schizosaccharomyces pombe depende de la formación de un anillo medio contráctil y de la acumulación de los parches de F-actina a su alrededor. Al final de la anafase comienza la contracción del anillo y la síntesis centrípeta del septo de división, el cual está compuesto por un disco central de beta(1-3)-D-glucano lineal, denominado septo primario, y por una estructura similar a la de la pared celular a ambos lados del mismo, denominada septo secundario, y cuya síntesis es esencial para la integridad celular. Últimamente ha aumentado considerablemente la información sobre la formación y la activación de la contracción del anillo medio. Sin embargo, aún no se conoce cómo se produce la síntesis del septo. S. pombe posee cuatro posibles subunidades catalíticas del complejo beta(1-3)-D-glucán sintasa (BGS), denominadas Bgs1p-4p. En esta tesis hemos estudiado la función de Bgs1p y Bgs4p en la síntesis del beta-glucano y su importancia para la formación del septo durante la citocinesis y el mantenimiento de la integridad celular. La proteína Bgs1p/Cps1p ha sido identificada como una hipotética subunidad catalítica de la (BGS), con una posible función durante la citocinesis y el crecimiento polarizado. Para estudiar esta posibilidad, se crearon mutantes dobles de cps1-12 y diferentes mutantes cdc de septación. Los mutantes dobles obtenidos presentaron distintos fenotipos de hipersensibilidad y alteraciones en la distribución de la actina. El análisis de las relaciones epistáticas de los mutantes dobles mostró que las mutaciones de los procesos anteriores a la síntesis del septo eran dominantes sobre cps1-12, mientras que cps1-12 era dominante sobre el mutante de finalización de la septación cdc16-116, lo que sugiere que Bgs1p está implicada en la síntesis del beta(1-3)-D-glucano de la pared celular del septo durante la citocinesis. Hemos estudiado la localización fisiológica in vivo de Bgs1p en una estirpe bgs1D que contiene un gen GFP-bgs1+ funcional (una única copia integrada del gen y expresada bajo el control de su propio promotor). Durante el crecimiento vegetativo, Bgs1p siempre se localiza en las zonas de crecimiento: en uno ó ambos polos durante el crecimiento celular, y en el anillo medio y septo durante la citocinesis. La localización de Bgs1p en los mutantes cdc de septación indica que Bgs1p necesita las proteínas del anillo medio y de la ruta de activación de la septación (SIN) para localizarse correctamente con el resto de los componentes de la septación. La localización de Bgs1p en el mutante de actina cps8-188 muestra que la localización de Bgs1p depende de la localización de la actina. Además, Bgs1p permanece polarizada en los polos y septos deslocalizados de los mutantes tea1-1 y tea2-1. Durante el proceso meiótico del ciclo de vida, Bgs1p se localiza en las proyecciones de conjugación, en la zona de contacto entre las células durante la fusión celular y en el área del cuello durante la formación del cigoto. También, la localización de Bgs1p sugiere que colabora en la síntesis de la pared de la proespora y de la espora. Durante la germinación de la espora, Bgs1p se localiza primero alrededor de la espora durante el crecimiento isotrópico, a continuación, en la zona de crecimiento polarizado y finalmente, en el anillo medio y septo. Al final de la división entre la espora y la célula, el desplazamiento de Bgs1p hacía el polo viejo ocurre únicamente en la célula. Todos estos datos muestran que Bgs1p se localiza en las áreas de crecimiento polarizado de la pared celular, y por lo tanto, proponemos que Bgs1p podría estar implicada en la síntesis del beta(1-3)-D-glucano lineal del septo primario, así como de un beta(1-3)-D-glucano linear similar, que podría ser necesario en otros procesos de crecimiento ó de reparación de la pared celular. También hemos estudiado la función de Bgs1p y demostramos que es la subunidad de una actividad BGS, responsable de la síntesis del beta(1-3)-D-glucano lineal y del septo primario que origina. Hemos analizado el efecto letal que produce la represión de la expresión de bgs1+ en un fondo genético bgs1D. Para ello, hemos construido una serie de vectores que expresan bgs1+ bajo el control del promotor reprimible por tiamina nmt1+-81X, y que abarcan un rango de represión de aproximadamente 500 veces. Al reprimir la expresión de bgs1+ las células siguen presentando un fenotipo silvestre incluso cuando los niveles de Bgs1p son ya indetectables indicando el nivel tan bajo de Bgs1p que necesitan las células. La represión de bgs1+ sólo muestra un fenotipo letal con los tres vectores con mayor nivel de represión, originando células ramificadas y con múltiples septos, lo que demuestra que Bgs1p tiene un papel esencial durante la septación. La represión ó la sobreexpresión de bgs1+ no muestra ninguna alteración del beta-glucano, pero sí un aumento considerable del beta-glucano de la pared celular. Sin embargo, la actividad BGS disminuye en ambos casos. Por otro lado, las células con niveles reducidos de Bgs1p muestran un incremento notable de Bgs3p. Estos resultados sugieren que Bgs1p forma parte de un complejo multiproteico de la actividad BGS, y que las alteraciones producidas por las variaciones de Bgs1p inducen procesos compensatorios de otras subunidades Bgs y de la alfa(1-3)-D-glucán sintasa (AGS). El análisis de la represión de bgs1+ mediante tinción con Calcofluor white, un compuesto fluorescente que marca específicamente las zonas de crecimiento de la pared celular (polos y septo), y mediante marcaje con anticuerpos monoclonales específicos contra el beta(1-3)-D-glucano lineal, muestra en ambos casos, una reducción de la tinción de los septos. Los estudios mediante microscopía electrónica de transmisión y mediante inmunomicroscopía electrónica confirman que los septos presentan grandes alteraciones en su estructura, debidas principalmente a los defectos ó a la ausencia del septo primario y del beta(1-3)-D-glucano lineal del mismo. La deleción de bgs1+ es letal, pero las esporas bgs1D son capaces de germinar y originar células que pueden crecer durante varios ciclos mitóticos hasta morirse, dando lugar a células gigantes, multiseptadas y ramificadas. Estas células son parecidas a las observadas durante la represión de bgs1+, pero carecen completamente del septo primario y del beta(1-3)-D-glucano lineal, y no se tiñen con el Calcofluor. Todos estos datos muestran que el septo primario no es necesario para la síntesis del septo, que Bgs1p es responsable de la síntesis del beta(1-3)-D-glucano lineal y que éste a su vez es responsable de la estructura del septo primario, y que el polisacárido de la pared celular que reconoce específicamente y con una alta afinidad el Calcofluor es el beta(1-3)-D-glucano lineal. Finalmente, en esta tesis hemos clonado bgs4+ y mostramos que Bgs4p es la única subunidad que se ha encontrado hasta la fecha que forma parte de la enzima BGS y que es esencial para mantener la integridad celular durante la citocinesis y el crecimiento polarizado. También mostramos que bgs4+, cwg1+ (cwg1-1 presenta una reducción del beta-glucano de la pared celular y de la actividad catalítica de la BGS) y orb11+ (orb11-59 está alterado en la morfogénesis celular) son el mismo gen. bgs4+ es esencial para la germinación de la espora. En células vegetativas la represión de la expresión de bgs4+ produce la lisis celular en los polos de crecimiento y principalmente en el septo, antes de la separación celular, lo que sugiere que Bgs4p es esencial para el crecimiento de la pared celular y para compensar un exceso de degradación de la pared celular durante la citocinesis. El análisis de la represión y de la sobreexpresión de bgs4+ sugiere que Bgs4p forma parte de un complejo catalítico multiproteico de la BGS, y que las alteraciones del beta-glucano de la pared celular producidas por las variaciones de Bgs4p inducen mecanismos compensatorios a través de las otras subunidades Bgs y de la AGS. Los estudios de localización en condiciones fisiológicas mostraron que Bgs4p se localiza en los polos de crecimiento, el anillo medio, el septo y en cada uno de los sitios donde se produce síntesis ó remodelación de la pared celular durante la diferenciación sexual: conjugación, formación del cigoto y de la espora, y germinación de la espora. Los requerimientos para una correcta localización de Bgs4p durante la citocinesis, así como el patrón de localización de Bgs4p durante la maduración de la espora, difieren de los de Bgs1p. Bgs4p aparece en el anillo contráctil después de que se detecte Bgs1p y un material del septo teñido por el Calcofluor white, sugiriendo que Bgs4p está implicada en un proceso posterior, de síntesis del septo secundario ó de todo el septo en general. A diferencia de Bgs1p, Bgs4p necesita el anillo medio pero no las proteínas de la ruta de activación de la septación (SIN) para localizarse con los otros componentes de la septación. Además, la localización de Bgs4p depende de las proteínas del establecimiento de la polaridad. Finalmente, Bgs4p depende de la F-actina para su deslocalización de las zonas de crecimiento y su relocalización en las mismas, pero no necesita la actina para mantenerse estable en los sitios de crecimiento, polos y septo. Todos estos resultados muestran, por primera vez, el papel esencial de una subunidad Bgs en la síntesis de un beta(1-3)-D-glucano, que es necesario para preservar la integridad de la célula durante la síntesis ó reparación de la pared celular. 2006-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/76539 [ES] En esta tesis se identifican nuevas proteínas efectoras o reguladoras de las vías de señalización de las GTPasas de la familia Rho. Para ello se plantea el estudio de la ORF SPBC4F6.12, que codifica una proteína homóloga a Pxl1 de S. cerevisiae y a la paxilina de células animales, se determina la posible relación de SpPxl1 con las GTPasas de la familia Rho, Rho1 y Cdc42 y se estudian las funciones de Pxl1 en S. pombe.; [EN] In this thesis we identify new effector or regulatory proteins of the signaling pathways of Rho family GTPases. It does so by studying the SPBC4F6.12 ORF, which encodes a protein homologous to S. Pxl1 paxilina cerevisiae and animal cells, determine the possible relationship SpPxl1 with Rho family GTPases, Rho1 and Cdc42 and functions are studied in S. Pxl1 pombe. 2010-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/22505 2009-01-19T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/22504 Las modificaciones epigenéticas tales como acetilación, fosforilación, ubiquitinación y ADP-ribosilación de las histonas influyen en la genética potencial del DNA. El nivel de acetilación de las histonas está controlado por las acetilatransferasas de histonas (HAT) y las Desacetilasas de histonas (HDAC). El patógeno humano Candida albicans puede crecer en al menos cuatro diferentes morfologías: levaduras, pseudohifas, hifas y clamidosporas. Las pseudohifas y las hifas son formas elongadas y se engloban bajo la denominación de formas filamentosas. El cambio entre todas las morfologías es resultado de compleja interacción entre factores internos y externos y está coordinado in parte por proteínas que regulan polaridad y que están conservadas en las células eucariotas. En C. albicans existen múltiples rutas de regulación que controlan la transición levadura-hifa. Estas rutas controlan la transcripción de un set de genes específicos de hifa, la mayoría de ellos codifican conocidos factores de virulencia. Efg1p es el mayor regulador morfogenético de C. albicans. Sin3p, un componente del complejo multiproteico de Desacetilasas de histonas Sin3p-Rpd3p en Saccharomyces cerevisiae, se une al promotor del gen EFG1. Con todos los datos obtenidos se propuso un modelo que explica la relación entre Efg1p-Sin3p y las HDAC en la morfogénesis de C. albicans. En esta levadura existen al menos cinco HDACs. El objetivo de este trabajo fue entender el papel de dos de ellas, Hos3p y Rpd3p en la regulación de la morfogénesis de la levadura patógena C. albicans.En este trabajo, se interrumpieron tres genes que codifican las proteínas Hos3p y Rpd3p (dos de ellos) en C. albicans y se analizó el papel de los mismos en la morfogénesis, en especial en la transición levadura-hifa.Las células carentes del gen HOS3 mostraron una morfología similar a la del silvestre tanto en medio sólido como en medio líquido, incluso durante la transición dimórfica. También fueron capaces de formar clamidosporas. Se analizó el perfil global de transcripción y se obtuvieron 233 genes cuya expresión se veía afectada por la interrupción del gen HOS3 tras la comparación del mutante ?hos3 y la cepa silvestre. Estos genes pertenecían a diferentes categorías funcionales, principalmente metabolismo, transporte celular y comunicación celular y transducción de la señal.C. albicans tiene dos genes homólogos al gen que codifica la HDAC Rpd3p en S. cerevisiae. Ambos genes fueron interrumpidos y el doble mutante presentaba alteraciones en la transición levadura-hifa y la formación de clamidosporas. Los mutantes sencillos presentaron fenotipo similar a la cepa silvestre. El doble mutante además presentó alterada la expresión de los genes implicados en el cambio dimórfico EFG1, CPH1, YWP1 y HWP.; Epigenetic modifications, such as acetylation, phosphorylation, methylation, ubiquitination, and ADP ribosylation, of the highly conserved core histones, H2A, H2B, H3, and H4, influence the genetic potential of DNA. The enormous regulatory potential of histone modification is illustrated in the vast array of epigenetic markers found throughout the genome. The histone acetylation level is balanced by histone acetyltrasferases (HAT) and histone deacetylases (HDAC). The human fungal pathogen, Candida albicans can grow in at least four different morphologies: yeast, pseudohyphae, hyphae and chlamydospore. Pseudohyphae and hyphae are both elongated and sometimes there has been little attempt to distinguish between them, as both are "filamentous forms" of the fungus. The switch between these forms is the result of a complex interplay of external and internal factors and is coordinated in part by polarity-regulating proteins that are conserved among eukaryotic cells. C. albicans uses a network of multiple signaling pathways to control the yeast-->hypha transition. These pathways control the transcription of a common set of hypha-specific genes, many of which encode known virulence factors. Efg1p is the mayor regulator of morphogenesis in C. albicans. Sin3p, a component of a specific histone deacetylase complex Sin3p-Rpd3p in S. cerevisiae, was shown to bind to the EFG1 promoter. A proposed model explains the relationship between Efg1p-Sin3p and HDAC in morphogenesis. C. albicans has at least five HDACs. The focus of our work was on understanding the role of two of them, Hos3p and Rpd3p in the regulation of the morphogenesis in the pathogen yeast C. albicans.In this work, we have disrupted three genes which codified to Hos3p and Rpd3p (two of them) in C. albicans and have analyzed their role in morphogenesis and especially in the yeast-hypha transition.Cells lacking of HOS3 gene could grow normally on solid or in liquid media, even during the yeast-hypha transition. ?hos3 cells were able to form normal chlamydospores. We have analyzed global transcription profile and we obtained 233 differentially expressed genes after comparison of the hos3 mutant with the C. albicans wild type strain. These genes belong to several functional categories mainly those involved in metabolism, cellular transport and cellular communication/signal transduction. C. albicans has two genes homologous to ScRpd3p. We have disrupted both genes and the double mutant showed an altered behaviour during the dimorphic switch and chlamydospores formation. Single mutants presented wild type phenotype. The double mutant has also altered the expression of EFG1, CPH1, YWP1 and HWP1, genes implicated in morphogenesis. 2009-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/22497 2009-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/22503 La formación de la pared celular de Schizosaccharomyces pombe requiere la actividad coordinada de enzimas involucradas en la biosíntesis y modificación de sus componentes, entre los que destacan por su abundancia los glucanos. El complejo enzimático ?-glucán-sintasa sintetiza ?-1,3-glucanos lineales, que permanecen desorganizados y solubles en álcali hasta que se establecen enlaces covalentes entre los ?-1,3-glucanos y otros componentes de la pared celular. Las transferasas de la pared celular cuyos sustratos son los ?-1,3-glucanos podrían estar desempeñando importantes funciones en el ensamblaje y reordenamiento de la pared celular. Diversas proteínas pertenecientes a la familia 72 de las glicosil-hidrolasas (GH72) con actividad ?-1,3-glucanosil-transferasa han sido caracterizadas en otros organismos (Gas1p, Gas2p y Gas4p de Saccharomyces cerevisiae, o Gel1p de Aspergillus fumigatus). La secuenciación del genoma de S. pombe ha permitido identificar cuatro genes (gas1+, gas2+, gas4+ y gas5+) que codifican cuatro hipotéticas proteínas pertenecientes a la familia GH72.Desde el punto de vista funcional, gas1p es esencial para la viabilidad celular durante el crecimiento vegetativo, ya que los mutantes carentes de este gen sólo son capaces de crecer en medios estabilizados osmóticamente. Por su parte, gas4p desempeña un papel básico en la construcción de la pared celular de las esporas. Finalmente, las proteínas gas2p y gas5p deben ejercer un papel minoritario en la síntesis de la pared celular vegetativa, ya que mutantes carentes de estos genes (o el doble mutante) no presentan defectos morfológicos significativos.Bioquímicamente, todas ellas poseen actividad ?-1,3-glucanosil-transferasa, aunque se diferencian por la especificidad de longitud de sustrato, el punto de corte y los productos generados. Todo ello, junto con las diferencias de expresión a lo largo del ciclo biológico, sugiere que las distintas proteínas de la familia GH72 presentes en S. pombe podrían estar realizando funciones complementarias, no solapantes, en la levadura de fisión.; The formation of the Schizosaccharomyces pombe cell wall requires the co-ordinated activity of enzymes involved in the biosynthesis and modification of its components, such as glucans. The ?-glucan-synthase complex synthesizes linear ?-1,3-glucans, which remain unorganized and alkali-soluble until covalent linkages are set up between ?-1,3-glucans and other cell wall components. Cell wall transferases using ?-1,3-glucans as substrates could perform important functions in the assembly and organization of the cell wall. Several proteins belonging to the glycoside hydrolase family 72 (GH72) with ?-1,3-glucanosyltransferase activity have been described in other organisms, such as the Saccharomyces cerevisiae Gas1p or the Aspergillus fumigatus Gel1p. At least four genes encoding putative ?-1,3-glucanosyl-transferases gas1+, gas2+, gas4+ y gas5+- have been identified in the S. pombe sequencing project. In this work, we report the characterization of gas1p, gas2p, gas4p and gas5p during the different stages of the life cycle and their catalytic activity.From the point of view of their functionality, gas1p is essential for cellular viability during vegetative growth, as gas1? null mutants are only able to grow in media supplemented with an osmotic stabilizer. gas4p plays an essential role during the construction of the ascospore wall, being necessary for spore germination. Finally, gas2p and gas5p seem to play a minoritary role in the synthesis of the cell wall, as gas2? and gas5? null mutants or gas2? gas5? double mutant do not show significant morphologic defects.From the biochemical point of view, all of them display ?-1,3-glucanosyl-transferase activity, although they differ in their specificity for the substrate length, the split point and the range of the generated products. Taking all the data into account, together with the differences in their expression profiles during the life cycle, it suggests that the GH72 proteins present in S. pombe may accomplish complementary, non-overlapping, functions in the fission yeast. 2008-01-01T00:00:00Z