http://hdl.handle.net/10366/3973 Fri, 01 May 2026 15:03:32 GMT 2026-05-01T15:03:32Z http://hdl.handle.net/10366/159114 [ES] La proteína tirosina fosfatasa tipo 13 no receptora (PTPN13) es una enzima intracelular con una estructura modular que puede funcionar como oncogén o gen supresor de tumores. PTPN13 presenta varios dominios, incluyendo KIND, FERM, PDZ y PTP. Se ha demostrado que PTPN13 interactúa con β catenina en células hematopoyéticas para regular la quiescencia de las células madre hematopoyéticas. En pacientes con síndromes de insuficiencia de médula ósea y leucemia linfoide aguda se han descubierto mutaciones en el gen PTPN13, como p.R1838Q, p.W1274C y p.S1004. Se investigan los efectos celulares de estas mutaciones en la línea germinal que afectan a PTPN13 en pacientes con LLA y síndromes de insuficiencia de médula ósea hereditaria. Se analizan las mutaciones en el gen PTPN13 y su efecto en la función de la proteína en células hematopoyéticas. Se encontró que las mutaciones disminuyen la estabilidad de PTPN13, lo que afecta los niveles de β catenina y dificulta la diferenciación eritroide y megacariocítica en células K562. En células del linaje linfoide, las mutaciones alteran la diferenciación linfoide disminuyendo o aumentando la expresión de ciertos marcadores. El silenciamiento de PTPN13 y β catenina afecta la diferenciación linfoide y la expresión de marcadores específicos, indicando su importancia en este proceso. Además, se observó que la reducción en la expresión de proteínas asociadas con la vía de señalización del BCR podría estar relacionada con el silenciamiento de PTPN13. Estos hallazgos sugieren que las mutaciones en PTPN13 pueden tener un papel patogénico en trastornos hematológicos, especialmente en el desarrollo de IBMFS y LLA. Mon, 01 Jan 2024 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/159114 2024-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/153142 [ES]La homeostasis celular se mantiene gracias a los sistemas de control de la síntesis y degradación de proteínas, como son el sistema ubiquitina-proteasoma, el de autofagia-lisosomal y las proteasas. En este sentido, las proteasas no lisosomales, conocidas como calpaínas, constituyen un sistema complejo de modulación de la función proteica durante el desarrollo de numerosas patologías, incluidas las neurológicas, como es la isquemia. Junto a la excitotoxicidad, la entrada intracelular de calcio, el control en la estabilidad proteica y la generación de especies reactivas de oxígeno, la activación de las calpaínas es un factor clave implicado en la muerte neuronal inducida por la cascada isquémica. Por tanto, las estrategias neuroprotectoras encaminadas a la interrupción de los mecanismos que desencadenan este fenómeno y, en concreto, el sistema de las calpaínas puede tener una importante relevancia en la resistencia frente al daño isquémico. Nosotros pensamos que el precondicionamiento isquémico, una conocida herramienta de neuroprotección endógena, podría estar implicado en la regulación del sistema de las calpaínas y por lo tanto en la respuesta de tolerancia isquémica neuronal. Con estos antecedentes, y puesto de manifiesto la importancia que posee el control de la estabilización de las proteínas durante la isquemia, en la presente Tesis Doctoral nos hemos propuesto identificar la función de las calpaínas durante la tolerancia neuronal en respuesta al daño isquémico. Sun, 01 Jan 2023 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/153142 2023-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/152740 [ES] La leucemia mieloide aguda (LMA) es la leucemia más diagnosticada en adultos. Su abordaje clínico es complejo debido, principalmente, a su gran heterogeneidad. Esto ha ocasionado que durante más de 50 años apenas se hayan introducido mejoras en su diagnóstico y tratamiento. Sin embargo, la revolución de las ciencias ómicas ha provocado que en los últimos 4 años el protocolo médico de diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la enfermedad se haya visto notablemente modificado. La reciente inclusión de varias mutaciones en la determinación pronóstica y la aprobación de hasta nueve nuevos agentes terapéuticos denota que la gestión clínica de la LMA está cambiando y que este tema es de actualidad. Pese a ello, la supervivencia a 5 años de la enfermedad sigue siendo inferior al 30%. Dos mecanismos moleculares, el metabolismo y la señalización redox, han demostrado estar involucrados en la hematopoyesis normal y en su versión tumorigénica, la leucemogénesis. Además, estos dos procesos se encuentran interconectados. Las especies reactivas del oxígeno (ROS), principales ejecutoras de la señalización redox, regulan el metabolismo; y este es el mayor productor de ROS. Con todo, los mecanismos que gobiernan esta relación redox-metabolismo requieren una investigación más profunda. En este sentido, destacan las NADPH oxidasas (NOX) por ser el único sistema celular cuya funcionalidad principal es la producción de ROS y, por tanto, tentativamente ser las enzimas clave para regular la señalización redox. En esta tesis estudiamos el papel de NOX2 en la LMA. NOX2 es el miembro de la familia de las NOX mayoritariamente expresado en células mieloides. Hemos descubierto que NOX2 tiene un papel importante regulando el metabolismo de la glucosa de células leucémicas, de modo que el descenso de los niveles de NOX2 provoca un metabolismo mitocondrial deficiente (ciclo de los ácidos tricarboxílicos y fosforilación oxidativa disminuidos), que puede ser compensado por un incremento glucolítico en células metabólicamente flexibles. Además, hemos visto que NOX2 también tiene un rol importante en la regulación del sistema glutation, donde bajos niveles de NOX2 se ven acompañados de un descenso en los niveles de glutation y una capacidad antioxidante comprometida. Así pues, NOX2 resulta fundamental para mantener un metabolismo mitocondrial activo y permitir la reposición de los depósitos de glutation en células de LMA. Conocer estas interacciones moleculares, nos permite proponer un tratamiento de inhibición de las NOX (iNOX) en combinación con inhibidores del metabolismo de la glucosa como estrategia terapéutica frente a la LMA. Esta combinación ha resultado eficaz en líneas celulares y células procedentes de pacientes con distinto fondo genético molecular. De entre las alternativas testadas, la inhibición de NOX junto con el tratamiento con oxamato (Ox) ha resultado la opción más atractiva por su alta efectividad y su moderada toxicidad en células sanas de médula ósea. La efectividad de iNOX+Ox es mayor cuanto más alta es la expresión de NOX2. Por ello, iNOX+Ox se muestra una alternativa interesante para pacientes con altos niveles de NOX2 como aquellos con fenotipo diferenciado, grupos FAB (clasificación French-American-British) M4 o M5, y quimiorresistentes. La adición de citarabina (Ara-C) a la combinación iNOX+Ox aumenta la potencia de la combinación induciendo más fuertemente la muerte celular. Según nuestros datos, la efectividad de la combinación parece deberse a la modulación que ejerce sobre el metabolismo energético y a una potente supresión de la capacidad antioxidante de la célula. Por último, en esta tesis presentamos un panel de 29 genes correlacionados (29G) con implicación en el metabolismo, entre los que se encuentra NOX2. Este panel tiene capacidad de clasificar a nivel pronóstico a los pacientes de LMA. Un paso más allá, la expresión de estos 29 genes nos ha permitido computar un índice que podría predecir la supervivencia de los pacientes en base a 29G. 29G también discrimina 4 grupos con distinta supervivencia dentro del grupo de pacientes con pronóstico intermedio. 29G podría mejorar la clasificación de un grupo tan heterogéneo como es el de pronóstico intermedio, que actualmente concentra a todos aquellos casos con alteraciones que no han sido catalogadas como favorables o adversas. Todos estos resultados coinciden en NOX2 y su influencia sobre el metabolismo como piezas angulares de la LMA. [EN] AML is the most commonly diagnosed leukemia in adults. Its clinical management is complex, mainly due to its great heterogeneity. Consequently, for more than 50 years there has been little improvement in its diagnosis and treatment. However, in the last 4 years the medical protocol for diagnosis, prognosis and treatment of the disease has been significantly modified owing to the revolution in the omics sciences. The recent inclusion of several mutations in the prognostic determination and the approval of nine new therapeutic agents indicate that the clinical management of AML is changing and that AML is a hot topic. Notwithstanding, the 5-year survival of the disease is still less than 30%. Two molecular mechanisms, metabolism and redox signaling, have been shown to be involved in normal hematopoiesis and its tumorigenic version, leukemogenesis. Moreover, these two processes are interconnected. Reactive oxygen species (ROS), the main executors of redox signaling, are involved in metabolic regulation and metabolism is the major producer of ROS. However, the mechanisms governing this redox metabolism relationship require further investigation. In this sense, NOX stand out as the only cellular system whose main functionality is the production of ROS and, therefore, tentatively as the key enzymes to regulate redox signaling and, further, its influence on metabolism. In this thesis we study the role of NOX2 in AML. NOX2 is the NOX family member mostly expressed in myeloid cells. We have found that NOX2 plays an important role in regulating glucose metabolism of leukemic cells. Decreased NOX2 levels lead to impaired mitochondrial metabolism (decreased tricarboxylic acid cycle and oxidative phosphorylation), which can be compensated by a glycolytic increase in metabolically flexible cells. In addition, we have shown that NOX2 also plays an important role in the regulation of the glutathione system, where low NOX2 levels are accompanied by decreased glutathione levels and compromised antioxidant capacity. Thus, NOX2 is critical for maintaining active mitochondrial metabolism and allowing replenishment of glutathione stores in AML cells. Knowledge of these molecular interactions allows us to propose a NOX inhibition (iNOX) treatment in combination with glucose metabolism inhibition as a therapeutic strategy against AML. This combination has been effective in cell lines and patients’ bone marrow mononuclear cells with different molecular-genetic backgrounds. Among the alternatives tested, NOX inhibition together with oxamate (Ox) treatment has proved to be the most attractive option due to its high effectiveness against tumoral cells and moderate toxicity in healthy bone marrow cells. iNOX+Ox shows greater effectiveness the higher the NOX2 expression. Thus, iNOX+Ox is an interesting alternative for FAB group patients with a differentiated phenotype, M4 or M5, and chemoresistant patients who have demonstrated high NOX2 expression. The addition of cytarabine (Ara-C) to the iNOX+Ox combination increases the potency of the combination by more strongly inducing cell death. Furthermore, according to our data, the effectiveness of the combination seems to be due to the modulation on energy metabolism and a potent suppression of antioxidant capacity exerted on cells. Finally, in this thesis we present a panel of 29 correlated genes (29G), including NOX2 and involved in metabolism, with the ability to prognostically classify AML patients. One step further, the expression of these 29 genes has allowed us to compute an index that could predict patient survival based on 29G. 29G also discriminates 4 groups with different survival rates within the group of patients with intermediate prognosis. 29G could improve the classification of such a heterogeneous group as the intermediate prognosis group, which currently concentrates all those cases with alterations that have not been classified as favorable or adverse. All these results coincide in NOX2 and its influence on metabolism as cornerstones of AML. Sun, 01 Jan 2023 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/152740 2023-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/152724 [ES] La investigación plantea como objetivo global de esta tesis doctoral profundizar en el estudio de la heterogeneidad del HCC en la huella genética de quimiorresistencia, investigar el efecto del silenciamiento de distintos TSGs relevantes en el HCC en la falta de respuesta a los tratamientos actuales y evaluar nuevas estrategias farmacológicas basadas en la inhibición selectiva de la iniciación de la traducción. Para alcanzar dicho objetivo global, se plantearon los siguientes objetivos parciales: Objetivo 1: Llevar a cabo un análisis retrospectivo de caracterización de la heterogeneidad en la huella genética de quimiorresistencia en pacientes con HCC, como base para realizar estudios posteriores que permitan desarrollar herramientas para predecir la falta de respuesta a la quimioterapia en los pacientes con este tipo de tumor. Objetivo 2: Desarrollar modelos celulares con silenciamiento total de diferentes TSGs relevantes en el HCC mediante la tecnología de edición genética programada CRISRP/Cas9. Objetivo 3: Estudiar in vitro la repercusión de la pérdida de función de los TSGs en la sensibilidad de líneas celulares de HCC a los fármacos antitumorales y en su fenotipo de malignidad. Objetivo 4: Evaluar in vitro el potencial terapéutico de una nueva estrategia farmacológica basada en la inhibición del factor de iniciación de la traducción eIF4A en el tratamiento del HCC. Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/152724 2022-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/151429 [ES] La LMC es un trastorno mieloproliferativo clonal producido por la translocación t(9;22)(q34;q11), conocida como el cromosoma Filadelfia. Esta translocación conduce a la yuxtaposición de los genes c-ABL1 (del inglés Abelson Leukemia Virus) y BCR (del inglés Breakpoint Cluster Region), generando así el gen quimérico BCR-ABL1 que codifica una oncoproteína con actividad tirosina quinasa que recibe el mismo nombre. La adquisición de este gen de fusión ocurre en una sola célula madre hematopoyética multipotente llamada célula madre de leucemia (LSC, del inglés Leukemic Stem Cells), que aún no está comprometida con la diferenciación mieloide o linfoide. De este modo BCR-ABL1 le aporta a esta célula una ventaja proliferativa y una capacidad de diferenciación aberrante responsables de la expansión de progenitores mieloides en la médula ósea. Si bien la sola presencia de BCR-ABL es suficiente para desencadenar la LMC, a medida que la enfermedad progresa aparecen nuevas alteraciones que modifican el comportamiento de las células leucémicas, reducen la sensibilidad a los tratamientos y favorecen aún más el avance a estados más similares a una leucemia mieloide aguda. Con la salida al mercado a principios de los años 2000 de los inhibidores tirosina quinasa (TKI) específicos contra BCR-ABL, el pronóstico de la LMC sufrió una revolución, pasando de ser una enfermedad de resultado fatal a una de pronóstico favorable. Aunque en gran parte de los pacientes el tratamiento continuado con TKI logra controlar la progresión de la enfermedad, la resistencia primaria o secundaria a estos tratamientos sigue suponiendo una grave amenaza, lo que justifica la búsqueda de nuevas opciones terapéuticas. BCR-ABL presenta actividad tirosina quinasa constitutiva, activando una plétora de vías de señalización como PI3K/AKT, MAPKs o STAT5 que son responsables del fenotipo proliferador, antiapoptótico y del bloqueo de la diferenciación característico de las células tumorales. Pero, además, BCR-ABL induce cambios en dos importantes características distintivas de las células leucémicas: produce un incremento de ROS (del inglés Reactive Oxygen Species) celulares y modifica las necesidades y dependencias metabólicas. Las ROS colaboran en el control de varías de las rutas de señalización controladas por BCR-ABL, y favorecen la aparición de mutaciones puntuales y ruptura de doble cadena por su gran poder oxidante. Una de la fuentes más fuertemente implicadas en la elevación de los niveles de ROS en LMC es la familia de enzimas NADPH oxidasas, cuya única función conocida hasta el momento es precisamente la de producir ROS. Esta familia de enzimas transmembrana se comprende de 7 miembros: NOX1-4, que son dependientes de la subunidad estabilizadora p22phox; y NOX5, DUOX1 y DUOX2 cuya actividad está regulada por calcio. La expresión de BCR-ABL induce la glucólisis aerobia, fenómeno conocido como efecto Warburg, al incrementar la entrada y metabolismo de la glucosa en detrimento de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) mitocondria, y su gran capacidad para generar energía. Pero este viraje metabólico hacia la glucólisis parece no tener lugar en las LSC donde la glucosa captada se destina al OXPHOS mitocondrial, entre otros factores por su menor dependencia de BCR-ABL para sobrevivir. Tanto la sobreproducción de ROS como los cambios metabólicos descritos se han relacionado con la resistencia y progresión de la LMC a etapas más agresivas de la enfermedad. Las ROS son capaces de modular el metabolismo celular al afectar directa o indirectamente a reguladores maestros del metabolismo como la AMPK o HIF1; así como gracias a su capacidad para oxidar directamente a enzimas metabólicas como la GAPDH, la PKM2 o la PDH. Así en esta tesis nos planteamos investigar el papel que podrían estar cumpliendo las ROS producidas vía NADPH oxidasas sobre la particular adaptación metabólica de las células de LMC. Así, decidimos silenciar el homólogo NOX2, el más fuertemente relacionado con las células hematopoyéticas, así como la subunidad estabilizadora p22phox, esencial para el funcionamiento de NOX1-NOX4 y encontramos que las células NOX2 silenciadas, pero no las p22phox silenciadas indujeron el flujo de glucosa a través de la glucólisis y la entrada de piruvato a la mitocondria en células K562 mediante el estudio del destino metabólico de la glucosa con 13C6-glucosa. Además, encontramos que el silenciamiento de NOX2 aumenta el OXPHOS mitocondrial y la producción de ROS mitocondriales. Este efecto estuvo acompañado de una reducción en la ruta de señalización PI3K/AKT/mTOR y una activación de GSK3β que puede ser responsable de algunas de las adaptaciones metabólicas descritas. El hecho de encontrar que el silenciamiento de NOX2, pero no el de p22phox inducía cambios metabólicos, nos llevó a plantear que, además de NOX2, otro miembro de la familia dependiente de p22phox estuviese implicado en la regulación del metabolismo de la LMC. Encontramos que silenciamiento de NOX2 incrementó los niveles de ARN mensajero de NOX4 y la expresión proteica de p22phox en células enteras y en extractos enriquecidos en mitocondrias. NOX4 es el homólogo de la familia más fuertemente relacionado con la mitocondria, existiendo diversos artículos que localizan a esta proteína en la mitocondria o en las uniones retículo endoplásmico (RE)-mitocondria, donde se le ha asignado una función en la regulación metabólica mitocondrial. Siguiendo esta idea, el análisis metabólico y transcriptómico avaló la existencia de un eje NOX2-NOX4-mitocondria, observando que el silenciamiento de NOX4 evita el incremento en el OXPHOS provocado por el silenciamiento de NOX2 y el enriquecimiento de vías relacionadas con el metabolismo. Por último, evaluamos el potencial terapéutico de la inhibición de las NADPH oxidasas junto con el inhibidor de la hexoquinasa, 2DG; el inhibidor de la lactato deshidrogenasa, oxamato; o con el inhibidor de la piruvato deshidrogenasa quinasa, el DCA. Encontramos que la inhibición química de las NOX presentó un fuerte efecto sinérgico con los inhibidores del metabolismo 2DG, DCA y oxamato en líneas celulares y muestras de pacientes de LMC, además de ser igualmente eficaz en el tratamiento de células resistentes a los TKI. Por último, la inhibición específica de NOX2 con GSK2795039 junto con el DCA redujo de manera sinérgica la proliferación y capacidad clonogénica tanto en líneas celulares como en muestras de pacientes de LMC. Todos estos datos en conjunto muestran la existencia de un eje funcional NOX2-NOX4-metabolismo en LMC con un importante potencial terapéutico para el tratamiento de esta leucemia. [EN] Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative neoplasia induced by the t(9;22)(q34;q11) translocation, also known as the Philadelphia chromosome. Such translocation leads to the juxtaposition of the c-ABL1 (Abelson Leukemia Virus) and BCR (Breakpoint Cluster Region) genes, generating the BCR-ABL1 chimeric gene that encodes an oncoprotein with the same name, that shows constitutive tyrosine kinase activity. The acquisition of this genetic fusion occurs in a single stem cell or leukemic stem cell (LSC), which is not yet compromised either to myeloid or lymphoid lineages. BCR-ABL1 provides proliferation advantage and triggers an aberrant myeloid differentiation, which eventually leads to the expansion of myeloid progenitors in the bone marrow. Although the mere presence of BCR-ABL1 seems sufficient to induce the disease, as the disease progresses, new genetic alterations appear that modify the behaviour of the leukemic cells, reduce treatment sensitivity, and further favour progression to disease phases that remember an acute leukaemia. The widespread use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) against BCR-ABL1 from the beginning of this century revolutionised CML treatment, the prognosis moved from dismal to very favourable. Although most patients respond well to prolonged TKI treatment, primary and secondary resistances are still a great threat, what justifies the search for novel therapeutic options. The constitutive activity of BCR-ABL is responsible of the activation of a plethora of signalling pathways such PI3K/AKT, MAPKs or STAT5, leading to the uncontrolled proliferation, apoptosis evasion and differentiation block that characterise CML cells. Moreover, BCR-ABL induces two important and distinctive features of leukemic cells: an enhanced production of Reactive Oxygen Species (ROS), and the alteration of metabolism. ROS are important for the maintenance of BCR-ABL induced signalling pathways, and they can induce oxidative damage leading to an enhanced rate of mutations and the appearance of DNA double strand breaks. One of the most prominent source of ROS in CML is the NADPH oxidase family. This family of enzymes is specialized in the production of ROS, which is its only known function; there are 7 members: NOX1-4, whose stability depend on the small transmembrane proteinp22phox; and NOX5, DUOX1 y DUOX2, whose activity is regulated by calcium. BCR-ABL expression induces an aerobic glycolysis, a phenomenon known as the Warburg effect, characterised by an enhanced oxidation of glucose through glycolytic pathway to the detriment of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS). However, this metabolic rewiring apparently does not occur in LSC; these cells rely metabolically on OXPHOS, and show a lower dependence on BCR-ABL for survival. Both, the overproduction of ROS and the metabolic rewiring, have been related with the appearance of resistances and disease progression to more aggressive stages. ROS can modify cellular metabolism due to their capacity of control of master regulators of metabolism such AMPK or HIF by direct or indirect mechanisms. Moreover, ROS can induce the oxidation of metabolic enzymes such GAPDH, PKM2 or PDH. Bearing the foregoing in mind, in this Thesis we aimed to investigate the role in CML metabolism of NADPH oxidase produced ROS. For this purpose, we decided to silence the expression of NOX2, the isoform most tightly related with haematopoietic cells, and the stabilising subunit p22phox, which is essential for the activity of for different complexes (NOX1-NOX4). By following the metabolic destiny of 13C6-glucose, we found that NOX2 silenced cells, unlike to p22phox silenced cells, enhanced the use of glucose through the glycolytic pathway, and the entry of pyruvate in the mitochondria. Besides, we also found that NOX2 silencing enhanced OXPHOS and the production of mitochondrial ROS, accompanied by the attenuation of the PI3K/AKT/mTOR pathway, and the activation of GSK3β, which may be responsible of some of the metabolic changes found. Considering that most of the metabolic changes observed in NOX2 silenced cells were not shared by p22phox silenced cells, we wondered whether another p22phox–dependent NOX, different from NOX2, was involved in the regulation of CML metabolism. We found that NOX4 mRNA levels were increased upon NOX2 silencing. At the same time, we also detected an increase of p22phox protein levels, both in whole cell extracts and in mitochondrial enriched fractions. Previous reports support a tight relation of NOX4 with the mitochondria. It has been reported the location of NOX4 in the mitochondria and in the mitochondria-ER contact sites (MERC); and the importance of this enzyme in the regulation of mitochondrial function is supported by the scientific evidence. In the same line, our metabolic and transcriptomic analyses support the existence of a NOX2-NOX4-mitochondria functional axis in CML cells, because NOX4 silencing prevent the enhancement in OXPHOS, and the enrichment of metabolism related pathways observed upon NOX2 silencing. Finally, we analysed the therapeutic potential of the simultaneous inhibition of NADPH oxidases and three different metabolism enzymes. Chemical inhibition of NADPH oxidases showed a synergistic effect upon combination with inhibitors for hexokinase (2DG), lactate dehydrogenase (oxamate), and pyruvate dehydrogenase kinase (DCA), both in CML cell lines and in patient cell samples. Such combinations showed also to be effective in TKI resistant cell lines. Finally, NOX2 specific inhibition with GSK2795039 plus DCA reduced synergistically cell proliferation and clonogenic capacity of CML cell lines and patient cell samples. In summary, our results support the existence of a functional axis NOX2-NOX4-mitochondria important for the regulation of CML metabolism and with a high therapeutic potential for the treatment of this leukaemia. Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/151429 2022-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/150471 [ES]El genoma de los organismos eucariotas está organizado en cromatina, estructura cuya unidad fundamental es el nucleosoma. Éstos, facilitan el empaquetamiento del DNA dentro del núcleo y son esenciales en su mantenimiento, permitiendo la regulación de procesos genómicos básicos para la función celular. El trabajo presentado en esta tesis doctoral pretende contribuir al conocimiento de la organización de los nucleosomas y su papel en procesos relacionados con la regulación del genoma en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe. Para ello se analizó la contribución de la organización nucleosómica a la regulación de la transcripción, la recombinación y la estabilidad genética, así como el papel de la secuencia del DNA en el posicionamiento de los nucleosomas. Los resultados obtenidos permitieron concluir que, en cuanto a la recombinación, la distribución de las roturas de doble cadena meióticas previas a la recombinación en Schizosaccharomyces pombe puede variar debido a cambios en las regiones libres de nucleosomas. Estos cambios, a su vez, dependen del patrón de expresión génica cuando la meiosis tiene lugar en diferentes condiciones fisiológicas. Además, las secuencias endógenas o exógenas con un elevado contenido en G+C tienen muy baja ocupación nucleosómica y generan regiones de hipersensibilidad, de manera que la exclusión de nucleosomas en esas regiones puede generar sitios de recombinación meiótica o alterar la transcripción de los genes adyacentes. En cuanto a la secuencia parece que las secuencias codificantes son más relevantes en el posicionamiento de los nucleosomas sobre los genes que la estructura de los promotores o la transcripción per se y que los nucleosomas de esta levadura son incapaces de generar un patrón regular de posicionamiento sobre secuencias de DNA exógeno, independientemente de su composición. Esto sugiere que sus nucleosomas, y quizás sus remodeladores de cromatina, han coevolucionado con su secuencia de DNA para optimizar el empaquetamiento del genoma en el núcleo. Esto esta apoyado por el hecho de que la modificación de secuencias exógenas según la composición de bases de DNA mononucleosómico de S. pombe, genera patrones de nucleosomas indistinguibles de los de los genes endógenos. Wed, 01 Jan 2014 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/150471 2014-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/149618 [ES] Las proteínas quinasas son enzimas encargadas de fosforilar proteínas específicas, es decir, catalizan la unión covalente de un grupo fosfato a residuos de treonina, serina o tirosina de las proteínas diana. El dominio quinasa o dominio catalítico de estas proteínas, formado por una secuencia de unos 250‐300 aminoácidos, está altamente conservado en la evolución [1]. La fosforilación es una modificación postraduccional que regula distintos procesos celulares, como la proliferación, diferenciación o el metabolismo, mediante cambios en la localización subcelular de las proteínas, en su interacción con otras moléculas, actividad o en su estabilidad [2–3]. Esta modificación está muy regulada en la célula, dada la importancia de los procesos en los que participa. Las fosfatasas son otro tipo de proteínas capaces de eliminar el grupo fosfato añadido por las quinasas [4]. En 1995 se describió el quinoma humano, en el que se encuentran clasificadas filogenéticamente las quinasas humanas. Esta clasificación fue ampliada en 2002 por Manning y colaboradores. Hasta la fecha, se han descrito 518 genes codificantes y 106 pseudogenes con secuencias de dominio quinasa. El quinoma se divide en 8 grupos y estos a su vez, en familias. La familia de las serina‐treonina quinasas VRK (del inglés Vacciniarelated kinase) se encuentra dentro del grupo caseína quinasa de tipo 1 (CK1) [1–5–6] y son en las que nos centraremos en este trabajo. Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/149618 2022-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/149361 [EN] Glioblastomas (GBMs), the most aggressive primary brain tumours with a median survival of 16 months, have high oncogenic c-Src activity. Glioblastoma stem cells (GSCs) rely on the acti- vity of this oncoprotein for survival, proliferation, stemness and invasion, and are responsible for GBM recurrence and hence the lethality of this tumour. Remarkably, a cell-penetrating peptide based on the physiologically inhibitory interaction of Cx43 and c-Src, TAT-Cx43266-283, specifically inhibits c-Src activity and consequently exerts potent anti-tumoral effects in human glioblastoma cells in vitro and in vivo, without affecting the survival or phenotype of healthy brain cells. In this PhD Thesis, we explored the impact of TAT-Cx43266-283 on pathways fundamental to GSC survival, especially under challenging conditions. As detailed in Chapter 1, we showed that TAT-Cx43266-283, through c-Src inhibition, decrea- sed glucose uptake and reduced oxidative phosphorylation without a compensatory increase in glycolysis in human GSCs. TAT-Cx43266-283 showed no effect on the metabolism of healthy brain cells, including rat neurons, human and rat astrocytes, and human neural stem cells. TAT-Cx43266- 283 impaired metabolic plasticity leading to reduced GSC growth and survival under different nu- trient environments. Importantly, mice glioma models in which GSCs were intracranially implan- ted with TAT-Cx43266-283 showed decreased levels of relevant metabolic targets for cancer therapy, such as hexokinase-2 (HK-2) and glucose transporter-3 (GLUT-3). Together, these results suggest that TAT-Cx43266-283 impairs metabolic plasticity specifically in GSCs in vitro and in vivo. Subsequently, as explained in Chapter 2, we found that TAT-Cx43266-283 blocks autophagic flux in GSCs, especially in nutrient-starvation induced dormant GSCs, and that this process parti- cipates in the anti-tumoral effect of the peptide. Remarkably, dasatinib, a c-Src inhibitor, could not replicate TAT-Cx43266-283 effect on dormant GSCs, revealing for the first time the involvement of pathways other than c-Src in TAT-Cx43266-283 effect. Finally, as presented in Chapter 3, we took advantage of state-of-the-art mass spectrometry proteomics to explore TAT-Cx43266-283 impact at the proteome level. This revealed an important number of pathways and proteins that may be acting as mediators of TAT-Cx43266-283 effect in GSCs. We combined the knowledge generated by this proteomic approach with publicly available GBM patient data to further our insights and identified several potential key proteins in the effect of TAT-Cx43266-283. In summary, the results presented in this PhD Thesis show how TAT-Cx43266-283, by inhibi- ting metabolic plasticity and autophagy, exerts potent, cell-specific and nutrient-context-indepen- dent anti-tumoral effects. In addition, our results open new avenues to continue the research effort into this promising molecule, in hopes of contributing to improve the outcome of GBM patients. Fri, 01 Jan 2021 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/149361 2021-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/149333 [ES] Una de las estrategias utilizadas en el diseño de fármacos consiste en vectorizar un compuesto de conocida actividad farmacológica o de diagnóstico mediante conjugación con otra molécula que le facilite su acceso de la forma más selectiva posible al tejido-diana. De esta manera, en el caso de la terapia antitumoral se pretende aumentar la llegada del fármaco al interior de las células cancerosas, limitando al máximo su acumulación en tejidos sanos y con ello reduciendo sus efectos secundarios. Se plantan dos objetivos: Objetivo 1: Obtención y evaluación in vitro de una familia de compuestos denominados BATKIs (Bile Acid-Tyrosine Kinase Inhibitor) con propiedades organotrópicas y antitumorales. Objetivo 2: Obtención y evaluación in vitro e in vivo de moléculas con vectorización hepatobiliar mediante ABs y portadores de un grupo con característica de fluorescencia en el infrarrojo cercano que denominaremos NIRBAD (Near Infrared Radiation Bile Acid Derivative) Con ello, Se ha sintetizado, purificado y caracterizado químicamente una nueva familia de derivados de ácidos biliares (AB) unidos a moléculas farmacológicamente activas que se utilizan actualmente en el tratamiento del cáncer de hígado (sorafenib y erlotinib) debido a que su actividad como inhibidores de receptores con actividad tirosina quinasa (TKI). Esta nueva familia denominada BATKI se ha diseñado a partir de una estrategia de conjugación entre las moléculas de interés que conlleva la formación de triazoles como fragmento de conexión entre ellas. Los BATKIs han demostrado actividad antiproliferativa de forma dosis-dependiente en modelos vectorizados con transportadores enterohepáticos y de hepatocarcinoma (HCC) y colangiocarcinoma humano (CCA), reduciendo la viabilidad celular con una potencia similar al fármaco del que derivan. En experimentos de 72 horas, su posible capacidad de vectorización se vio enmascarada por otros procesos de captación inespecífica. Sin embargo, en ensayos de citotoxicidad en periodos de exposición de 6 horas los BATKIs mostraron una actividad antitumoral superior en las líneas de HCC que sobreexpresaban transportadores de ABs, lo que revela su capacidad de vectorización. Los estudios de captación realizados utilizando la citometría de flujo para identificar los posibles transportadores de ABs que podrían ser la vía de entrada de los compuestos sintetizados, mostraron que moléculas derivadas de ABs funcionalizadas con un fluoróforo en la cadena lateral y, por tanto, con una estructura similar a los BATKIs como es la colilglicilamidofluoresceína (CgamF), pueden ser sustratos de OATP1B3. Los resultados obtenidos en estudios de docking fueron concordantes con los obtenidos en ensayos biológicos, ya que las energías de unión en el complejo enzima- sustrato entre diferentes TKRs y los compuestos BATKI o su subproducto de hidrólisis son muy similares a las encontradas por cristalografía de RX del TKI del que derivan. Fri, 01 Jan 2021 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/149333 2021-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/149317 [ES] La esclerosis múltiple es una enfermedad autoinmune, inflamatoria, crónica y neurodegenerativa del sistema nervioso central. Se trata de la enfermedad neurodegenerativa más prevalente en nuestro entorno y afecta principalmente a adultos jóvenes, sobre todo mujeres. Desde que se demostrara la relación entre la vitamina D y el riesgo y pronóstico de la enfermedad, se han realizado diversos estudios con el fin de establecer el posible papel de otros componentes de la dieta en el riesgo y pronóstico de la enfermedad. Todavía no se cuenta con estudios lo suficientemente amplios y las evidencias hasta la fecha no son concluyentes, pero resultados previos sugieren que otras moléculas dietéticas, como los ácidos grasos poliinsaturados omega- 3 DHA y EPA, la vitamina B12, la vitamina B6, el folato, así como diversos polifenoles, podrían tener cierta importancia a la hora de establecer unas pautas dietéticas en estos pacientes. En los últimos años también se ha puesto el foco en la homocisteína, cuyos niveles parecen ser más elevados en pacientes con EM, aunque los mecanismos por los que se da este hecho están aún por dilucidar. Determinar si la homocisteína es más elevada en estos pacientes es uno de los objetivos de este trabajo. Este aumento podría afectar negativamente al curso de la enfermedad tanto por su carácter neurotóxico como por implicar que los niveles de metionina circulantes sean menores lo que a su vez perjudicaría a los procesos de remielinización. Asimismo, las dietas hipocalóricas bajas en grasas de origen animal podrían suponer cierta neuroprotección al inhibir la actividad inflamatoria y el estrés oxidativo asociado. Las evidencias actuales no permiten todavía establecer aun unas pautas dietéticas concretas pero este estudio establecerá unos criterios sobre los que basar la nutrición de estos pacientes. Fri, 01 Jan 2021 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/149317 2021-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/145457 [ES]La fermentación es un proceso biotecnológico natural utilizado por la humanidad desde la antigüedad para la elaboración de alimentos y bebidas (Hutkins, 2008). Durante miles de años los procesos de fermentación eran espontáneos,y no fue hasta la década de 1850-60,que el químico y microbiólogo francésLouis Pasteur demostró que el proceso lo realizaban células vivas (Barnett, 2000), cuandose comenzó arealizarlasfermentaciones de forma controlada, mediante la adición del microorganismosu microorganismos fermentantes. Al organismo o mezcla de ellos se le denomina inóculo o estárter.La producción de alimentos tales como el pan, el yogurt, vino, cerveza o embutidos requieren de procesos fermentativos. La elaboración de esos alimentos y bebidas fermentadas se hace mediante el crecimiento controlado de microorganismos en lamateria prima y la adición de enzimas u otros compuestos Wed, 01 Jan 2020 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/145457 2020-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/145299 [ES] En 2017 la Organización Mundial de la Salud lanzó un informe del Sistema Mundial de Vigilancia de Resistencia a los Antimicrobianos GLobal Antimicrobial Resistance Surveillance System (GLASS report) donde se reportaron altos niveles de resistencia antimicrobiana en los diferentes países del mundo, y las acciones a implementar para evitar el incremento de este problema de salud pública (OMS, 2017). Wed, 01 Jan 2020 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/145299 2020-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/144241 [ES] Los organismos han evolucionado durante miles de años a través de su metabolismo, extrayendo electrones del medio que los rodea para producir su propia energía. Este sistema se ha ido perfeccionando con los años, obteniendo electrones de compuestos más complejos y utilizando diferentes moléculas como aceptores para esos electrones. El flujo de electrones no ha sido perfecto y ha dado lugar a la aparición ocasional de electrones desapareados, denominados radicales y que poseen un abaja estabilidad. Es por esto que se han considero nocivos y se ha buscado la forma de eliminarlos. Durante las últimas décadas, se ha descubierto que los organismos aprenden a utilizar alguno de sus compuesto en su propio beneficio, y por esto mediante esta tesis se pretende la función de las ROS durante la hematopoyesis in vivo, y en especial al papel fundamental que pueden estar cumpliendo sus principales enzimas productoras, las NADPH oxidasas. Wed, 01 Jan 2020 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/144241 2020-01-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/140569 [ES] La conservación de la energía cerebral requiere la cooperación entre dos tipos de células metabólicamente distantes; las neuronas y los astrocitos. Las neuronas dependen en gran medida de la fosforilación oxidativa mitocondrial para su función y supervivencia. Para ello, utilizan sustratos fácilmente oxidables como el lactato suministrado por los astrocitos, que son más glucolíticos. Así, la cadena respiratoria mitocondrial está estrechamente organizada y es eficiente en las neuronas, pero está poco ensamblada y es menos eficiente en los astrocitos. Como consecuencia, la generación mitocondrial de especies reactivas de oxígeno (ROS) es mucho menor en las neuronas que en los astrocitos. Sin embargo, se desconoce si los abundantes niveles de ROS mitocondriales (mROS) en los astrocitos desempeñan alguna función fisiológica. En esta tesis nos propusimos investigar esta posibilidad. Para abordar este problema, hemos generado un ratón que sobreexpresa una versión mitocondrial de la enzima catalasa (mitoCatalasa, mCAT) con la idea de disminuir persistentemente los niveles de mROS en los astrocitos durante la edad adulta. Comprobamos la eficiencia in vitro e in vivo de la reducción de mROS astrocíticos. Posteriormente, los resultados de transcriptómica, metabolómica, flujos metabólicos, junto con la inmunohistoquímica y el escrutinio del comportamiento de estos ratones revelaron alteraciones significativas a nivel cerebral en diversas vías metabólicas y modificaciones estructurales a nivel neuronal, compatibles con los leves defectos cognitivos observados. En concreto, los datos revelan que los mROS astrocíticos regulan, al menos, la utilización de la glucosa a través de la glucolisis y la vía de las pentosas fosfato (PPP). Este proceso es esencial para asegurar el apoyo metabólico que los astrocitos ejercen sobre las neuronas. Por tanto, nuestro trabajo demuestra que los mROS endógenos astrocíticos tienen una relevancia funcional que garantiza la correcta cooperación metabólica entre astrocitos y neuronas, necesaria para la bioenergética y supervivencia neuronal. Por último, este nuevo modelo animal podría ser una estrategia útil también como herramienta para combatir el estrés oxidativo en modelos de enfermedades neurológicas y estudiar aspectos celulares de este tipo de estrés. En resumen, nuestro trabajo revela propiedades de la señalización redox y su relación con la coordinación del metabolismo en el sistema nervioso central (SNC). También, pone de manifiesto la relevancia de los astrocitos en la regulación de funciones superiores del SNC como la conducta animal. Nuestros resultados sugieren que el estudio de la señalización redox requiere distinguir el origen celular de los ROS y explorar la función fisiológica como medio para comprender la intervención patológica. Por tanto, en nuestra opinión, este trabajo contribuye a la consideración de nuevos factores que deberán tenerse en cuenta en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas basadas en el uso de sistemas antioxidantes. English summary Brain energy conservation requires cooperation between metabolically distant cell types, notably neurons and astrocytes. Neurons, which strictly depend on mitochondrial oxidative phosphorylation for function and survival, utilize easily oxidizable substrates supplied by astrocytes, which rely upon glycolysis. Therefore, the mitochondrial respiratory chain is tightly organized and efficient in neurons, but loosely assembled and less efficient in astrocytes. Consequently, the mitochondrial generation of reactive oxygen species (ROS) is minimized in neurons and relatively elevated in astrocytes. However, whether the naturally abundant mitochondrial ROS in astrocytes have any physiological function is unknown. To address this issue, a genetically-engineered mouse was herein generated to persistently lessen mitochondrial ROS in astrocytes during adulthood. Transcriptomics, metabolomics, biochemical, immunohistochemical and behavioural scrutiny of these mice revealed significant alterations in specific pathways of brain redox, carbohydrate, lipid and amino acid metabolic pathways affecting neuronal function and mouse behaviour. We find that astrocytic mitochondrial ROS (mROS) regulate at least glucose utilization via glycolysis and pentose-phosphate pathway. This process is essential to ensure the metabolic support that astrocytes exert on neurons, which modulates neuronal bioenergetics and, potentially, survival. Our data provide further molecular insight into the metabolic cooperation between astrocytes and neurons and demonstrate that astrocytic mitochondrial ROS are important regulators of organismal physiology sustaining brain metabolism and neuronal function in vivo. Wed, 01 May 2019 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/140569 2019-05-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/140567 [ES] Un estímulo subtóxico en el cerebro (PC) promueve una situación de resistencia transitoria, que lo protege frente a un daño isquémico agudo posterior. Este estado de tolerancia isquémica se debe a la activación de mecanismos endógenos que promueven la supervivencia neuronal (Dirnagl et al., 2009, 2003; Gidday, 2006; Kirino, 2002; Wang et al., 2015). De hecho, se ha observado que aquellos pacientes que sufren, previo al ictus, uno o varios AITs presentan un mejor pronóstico funcional que aquellos pacientes sin AIT (Schaller, 2005; Wang et al., 2017; Wegener et al., 2004). Por ello, en la actualidad, se considera al AIT como el correlato clínico de una situación de PC. Así, el PC constituye una herramienta experimental eficaz en la identificación de las vías de neuroprotección asociadas a la tolerancia neuronal y frente a la isquemia. El empleo de dos modelos de PC distintos (NMDA-PC e IPC) ha permitido identificar, tanto in vitro como in vivo, las vías de señalización p53/PUMA/Caspasa-3 y Akt/MDM2/p53 con un papel clave en el balance entre la supervivencia y la muerte neuronal tras la isquemia. Así, el PC induce la fosforilación temprana de Akt, cuya activación promueve la fosforilación de MDM2 y posterior translocación al núcleo celular. De este modo, se fomenta la formación del complejo MDM2-p53, clave para la desestabilización de la proteína p53. Todo esto previene la activación de la vía proapoptótica p53/PUMA/Caspasa-3 y favorece la supervivencia neuronal tras la isquemia (Vecino et al., 2018). Resultados previos de nuestro grupo han identificado que el polimorfismo humano o SNP Arg72Pro de Tp53 modula la susceptibilidad de las neuronas a la isquemia y condiciona el pronóstico funcional de pacientes de ictus isquémico y hemorrágico (Gomez-Sanchez et al., 2011). Además, este SNP determina la neovascularización y recuperación neurológica tras el ictus hemorrágico (Rodríguez et al., 2017). En este sentido, hemos identificado la función moduladora del polimorfismo Arg72Pro de Tp53 en la supervivencia neuronal asociada al PC y su relevancia clínica en el pronóstico funcional de pacientes que experimentan un AIT previo al ictus (Ramos-Araque et al., 2019). Mon, 01 Jul 2019 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/140567 2019-07-01T00:00:00Z http://hdl.handle.net/10366/137444 [ES] El cáncer de mama es una enfermedad de génesis compleja, con un componente de genética cuantitativa que contribuye a la variabilidad en la susceptibilidad y en la evolución de la enfermedad entre individuos. La distinta respuesta a la quimioterapia entre pacientes con aparentemente la misma enfermedad es el resultado de diferencias en interacciones entre múltiples fenotipos intermedios que participan en el proceso patogénico del cáncer de mama. Muy a menudo, cada uno de estos fenotipos intermedios es a su vez un rasgo complejo que sigue un patrón de herencia de genética cuantiativa. En este trabajo, proponemos que el análisis de estos fenotipos intermedios podría ser una estrategia para explicar parte de la variabilidad en la evolución del cáncer de mama en presencia de quimioterapia y sin ella. Con este objetivo, hemos estudiado diferentes aspectos de la evolución tumoral sin tratamiento, y en respuesta a docetaxel y doxorrubicina, en poblaciones de ratones genéticamente heterogéneas con cáncer de mama HER2 positivo. A continuación, analizamos varios fenotipos de la biología tumoral como la presencia de distintas mutaciones oncogénicas, la longitud telomérica tumoral, la actividad de varias vías de señalización tumorales, la composición celular del tumor y su índice proliferativo. Hemos encontrado numerosas asociaciones entre estos parámetros tumorales y la evolución clínica de la enfermedad que sugieren que estos parámetros tumorales pudieron contribuir a la heterogeneidad en la evolución clínica observada en los ratones estudiados. Finalmente, hemos identificado un número de regiones genómicas donde las diferencias en el genotipo se asociaron con diferencias en la evolución clínica del tumor y en los fenotipos tumorales intermedios estudiados. Todas estas regiones podrían contener determinantes genéticos de la evolución del cáncer de mama sin tratamiento y de la respuesta a la quimioterapia con docetaxel y doxorrubicina. Sun, 01 Jan 2017 00:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10366/137444 2017-01-01T00:00:00Z