Análisis de la población bacteriana endofita presente en nódulos de "Lupinus": interacción y localización "in situ"

Abstract

Este trabajo de tesis se realizó en tres áreas diferentes que se interrelacionan entre sí. En la primera estrategia se realizó el aislamiento de bacterias del género Micromonospora a partir de nódulos de Lupinus angustifolius. De este ensayo se obtuvieron 61 cepas que fueron reunidas en cinco grupos mediante las técnicas moleculares de BOX-PCR, TP-RADP y Microsatélites. A partir de los grupos formados se escogieron 22 cepas a las cuales les secuenció el gen ribosómico 16S. Con las secuencias obtenidas se construyó el árbol filogenético teniendo en cuenta las cepas tipo de Micromonospora descritas. Se encontró que las cepas aisladas presentaban porcentajes de similitud entre el 98% y 99% con las cepas tipo: Micromonospora fulviviridis DSM 43906T, Micromonospora echinospora DSM 43816T, Micromonospora chaiyaphumensis JCM 12873T y Micromonospora olivasterospora DSM 43868T, lo cual indica que algunas cepas puedan representar nuevas especies. En la segunda parte del trabajo, se demostró que bacterias fijadoras de nitrógeno diferentes de Bradyrhizobium, forman nódulos y fijan nitrógeno en la planta Lupinus albus. Inicialmente a partir de los nódulos se aislaron 23 cepas denominadas Lupsa y mediante ensayos de nodulación se eligió a la cepa Lupsa 11 como modelo para los demás experimentos. El análisis del gen ARNr 16S de la cepa Lupsa 11 mostró que pertenecía al género Paenibacillus. Dicha cepa se utilizó en los ensayos de nodulación de Lupinus albus y después de 6 semanas de cultivo, se encontró que las plantas presentaban nódulos efectivos en las raíces y que fueron capaces de reducir el acetileno. En ensayos adicionales se encontró que la cepa Paenibacillus Lupsa11 crecía en medios de cultivo sin nitrógeno y además, que contenía el gen nifH el cual mostró un 99% de similitud con respecto al gen nifH de la cepa Frankia alni ACN14a.En la tercera parte del trabajo se detectó la colonización de las bacterias Micromonospora y Paenibacillus en el interior de los nódulos de Lupinus empleando la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Las sondas marcadas con Cy5.5 fueron altamente selectivas e hibridaron de manera específica con las bacterias presentes en el cortex interno del nódulo y no se unieron a otros sitios como es el tejido intercelular.

This PhD work was conducted in three different interrelated areas of knowledge. The first strategy followed consisted in the isolation of bacteria from the genus Micromonospora located inside nodules formed by Lupinus angustifolius. 61 strains were obtained from these experiments and grouped in 5 different groups with the following techniques: BOX-PCR, TP-RAPD and microsatelites. From the 5 groups mentioned, 22 strains were chosen for sequencing 16s rRNA gene. With these sequences a phylogenetic tree was made, including also Micromonospora strains that are already described. The strains isolated were a 98 to 99% similar to the following type strains: Micromonospora fulviviridis DSM 43906T, Micromonospora echinospora DSM 43816T, Micromonospora chaiyaphumensis JCM 12873T y Micromonospora olivasterospora DSM 43868T Micromonospora. This indicates the possible presence of new species within these strains.In the second part of the work, the fact that nitrogen fixating bacteria different that Bradyrrhizobium can develop nodules and fix nitrogen in Lupinus albus was demonstrated. 23 strains were isolated from nodules, and received the name Lupsa . One of the strains, Lupsa 11, was chosen by means of nodulation analysis as the specimen for the rest of the experiments. With the analysis of the 16s rRNA gene from the strain Lupsa 11, it was concluded that it belonged to the genus Paenibacillus. Said strain was used in the Lupinus albus nodulation experiments, and after 6 weeks, plants were found to have effective nodules in their roots that could reduce acetylene. Further experiments demonstrated that Paenibacillus Lupsa 11 could grow in media lacking nitrogen, and had the gene nifH, which had a 99% of similarity with the gene nifH from Frankia alni ACN14a.The third group of experiments were conducted to find Micromonospora and Paenibacillus bacteria inside nodules from Lupinus, using the fluorescent in situ hybridization technique (FISH). Probes tagged with Cy5.5 dye were highly specific and hybridized specifically with bacteria present in the inner cortex of the nodule, but not with any other structure, such as the intercellular tissue.