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Título
The Bul2/Rsp5 ubiquitin ligase complex promotes cohesin-mediated fork re-start
Autor(es)
Director(es)
Materia
Tesis y disertaciones académicas
Morphology, cell biology, pathology
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Biología molecular
Fecha de publicación
2016
Resumen
[ES]En el presente proyecto de Tesis doctoral, se aplicaron técnicas genéticas, genómicas, de biología molecular y proteómica para caracterizar el papel desempeñado por Bul2/Rsp5 en la respuesta celular a estreses genotóxicos. Se demostró que mutantes en los genes BUL2 (bul2) y RSP5 (rsp5-1 y rsp2-25) son sensibles a estrés replicativo inducido por tratamiento con hidroxiurea (HU). La deleción de Ubp2, ubiquitín proteasa que elimina cadenas de ubiquitina dependientes de Rsp5, suprime la sensibilidad de células bul2a altas dosis de HU. Análisis de los intermedios de replicación mediante geles bidimensionales de ADN (2D) en mutantes de deleción bul1bul2identificaron defectos en la reiniciación de horquillas de replicación paradas mediante tratamiento con 200mM HU. Utilizando la secuenciación masiva se pudo constatar que el defecto en reinicio y progresión de horquillas de replicación era característica común a lo largo del genoma. Estos resultados indican que eventos de ubiquitinación dependientes del complejo Bul2/Rsp5 son esenciales para reiniciar horquillas de replicación y así sobrevivir a estrés replicativo. Una análisis de espectrometría de masas (MS) realizada en el laboratorio identificó entre los interactores físicos de Bul2 el complejo Mec1/Ddc2 y las subunidades Smc1 y Smc3 del complejo cohesina. Mec1 es la quinasa apical de la respuesta del checkpoint y actúa como sensor de estrés replicativo a través de su reclutamiento a nivel de horquillas paradas por parte del adaptador Ddc2. Demostramos que la interacción de los complejos Bul2/Rsp5 y Mec1/Ddc2 estaba incrementada en células tratadas con HU y resultó independiente de la actividad quinasa de Mec1. Explorando el significado funcional de la interacción entre los dos complejos, ensayos de Pull Down en células expuestas a estrés replicativo no permitieron identificar formas ubiquitinadas de Ddc2 dependientes del complejo Bul2/Rsp5. Igualmente, mediante geles Phos-tag de proteínas, se observaron formas fosforiladas de Bul2 y Rsp5; si bien estos eventos post-traduccionales no requerían la actividad quinasa de Mec1. La análisis mediante inmunoprecipitación de cromatina seguida de hibridación de arrays genómicos (ChIPchip) de las regiones de unión de Bul2 al ADN en células tratadas con HU identificó una correlación entre las regiones cromosómicas de Bul2 y Ddc2, sugiriendo que la interacción con el complejo Mec1/Ddc2 dirige la actividad de Bul2/Rsp5 a las horquillas de replicación paradas.
Entre los interactores físicos de Bul2 identificados por espectrometría de masas encontramos también las subunidades Smc1 y Smc3 del complejo cohesina. La función principal de cohesina en el ciclo de duplicación del genoma es la unión de cromatidas hermanas. Esta unión se establece a lo largo de la fase S de replicación de ADN y es destruida en el momento de la separación de las cromatidas en anafase durante mitosis. Demostramos, mediante ensayos de co-immunoprecipitación, la interacción entre el complejo ubiquitín ligasa Bul2/Rsp5 y las subunidades Smc1 y Smc3 en células tratadas con HU. Además observamos que mutantes en cohesina (smc1-259) acumulaban defectos en el reinicio y en la progresión de horquillas en presencia de estrés replicativo.. Analizando el significado biológico de la interacción entre coesina y Bul2/Rsp5, el grupo de investigación evidenció, mediante ensayos de Pull Down en células tratadas con HU, eventos de ubiquitinación de las subunidades Smc1, Smc3 y Scc1 dependientes del complejo Bul2/Rsp5. Se demostró también que la deleción de UBP2 suprimía la sensibilidad de mutantes de cohesina (smc3-42) a altas concentraciones de HU, sugiriendo que los eventos de ubiquitinación dependientes de Bul2/Rsp5 promueven la función de cohesina en respuesta a estrés replicativo.
Los datos recogidos en este trabajo de Tesis doctoral nos permiten proponer un modelo para la función del Bul2/Rsp5 en la respuesta de checkpoint de replicación. Según el modelo, cuando células sufren estrés replicativo, el complejo Bul2/Rsp5 es reclutado a las horquillas de replicación paradas dónde promueve la ubiquitinación del complejo cohesina. Tal ubiquitinación activaría el remodelamiento de la misma cohesina para favorecer el reinicio de la replicación.
1. ANTECEDENTES
Las células eucariotas deben preservar la integridad de sus genomas. Condiciones en las que se verifica una elevada instabilidad genómica, caracterizada por la aparición y amplificación de mutaciones y aberraciones de cromosomas, se asocian con una elevada predisposición al desarrollo de cáncer y patologías humanas. En respuesta a estrés replicativo las células eucariotas han evolucionado un mecanismo de vigilancia, llamado “DNA replication checkpoint”, que detecta la detención de las horquillas de replicación y activa una respuesta finalizada a detener la progresión del ciclo celular, estabilizar frágiles intermedios de replicación y promover la reparación de daños al ADN. Un escrutinio genético de genoma completo de la levadura Saccharomyces cerevisiae realizado por el equipo de investigación ha permitido identificar nuevos factores interrelacionados con la respuesta de checkpoint de replicación de ADN. Entre estos factores se identificó el gen BUL2, que codifica por el adaptador del complejo ubiquitín ligasa Bul2/Rsp5, previamente implicado en la desactivación de proteínas mediante proteólisis o relocalización subcelular y cuyos homólogos humanos, que pertenecen a la familia NEDD4, participan en procesos de trasformación maligna y desarrollo del cáncer.
2. HIPÓTHESIS DE TRABAJO
El complejo Bul2/Rsp5 media la poli-ubiquitinación de factores específicos con la consecuente degradación o relocalización de los mismos. Datos del equipo de investigación demuestran que la eliminación de Bul2 conlleva una hipersensibilidad al tratamiento con agentes genotoxicos, por tanto, la hipótesis de este proyecto sostiene que Bul2/Rsp5 juegan un papel importante en la respuesta a estrés replicativo.
3. OBJETIVOS GENERALES
El objetivo principal de este proyecto de Tesis doctoral es definir el papel de Bul2/Rsp5 en la respuesta celular a estrés replicativo: i) caracterizar los mecanismos moleculares que definen la función de Bul2 en células expuestas a estrés replicativo; ii) identificar las dianas celulares de la ubiquitinación mediada por Bul2 relevantes para la respuesta a estrés replicativo; iii) caracterizar la función de las dianas de Bul2 en respuesta a la parada de horquillas de replicación.
4. CONLUSIONES GENERALES
Los datos presentados en este proyecto de Tesis doctoral nos permiten presentar las siguientes conclusiones: i) eventos de ubiquitinación dependientes del complejo Bul2/Rsp5 son esenciales para reiniciar horquillas de replicación y así sobrevivir a estrés replicativo; ii) la interacción con el complejo Mec1/Ddc2 dirige la actividad de Bul2/Rsp5 a las horquillas de replicación paradas; iii) Bul2/Rsp5 promueve el papel de cohesina en la estabilización y reinicio de horquillas de replicación paradas.
URI
DOI
10.14201/gredos.132814
Colecciones
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Tamaño:
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Descripción:
Tesis