Functional analysis of a truncating variant of RAD51B and two ultraconserved genomic elements in gametogenesis

Abstract

[ES] La gametogénesis de mamíferos, cuyo objetivo final es generar gametos haploides a partir de células diploides, representa uno de los procesos de diferenciación más complejos en la biología del desarrollo y requiere una regulación precisa de la expresión génica. Si bien se ha generado un vasto conocimiento en este campo a lo largo de décadas, aún quedan por comprender a fondo varios aspectos en cuanto a su regulación. En la presente tesis se ha llevado a cabo el análisis funcional de una familia con infertilidad hereditaria y dos elementos ultraconservados de mamíferos, HS205 y HS1442, potencialmente implicados en la gametogénesis. La insuficiencia ovárica primaria (POI, por sus siglas en inglés) causa infertilidad femenina al anular la función ovárica normal. Aunque la etiología genética de este trastorno se ha investigado ampliamente, la mayoría de los casos de POI siguen sin explicación. RAD51B es un miembro de la familia de recombinasas RAD51. Los resultados de la secuenciación del exoma completo de una familia con POI identificaron una variante truncada homocigótica en RAD51B-(c.92delT) en dos hermanas afectadas. Los estudios in vitro revelaron que esta variante conduce al reinicio de la traducción en el codón 64 de AUG. Aquí mostramos que se trata de una variante hipomórfica patógena en un modelo de ratón. Los ratones Rad51bc.92delT/c.92delT exhibieron defectos de reparación del ADN meiótico debido a la acumulación de γH2AX, RAD51 y HSF2BP/BMRE1 en los ejes cromosómicos, lo que provocó una reducción en el número de entrecruzamientos. Curiosamente, la interacción de RAD51B-c.92delT con RAD51C y con sus interactores recientemente identificados RAD51 y HELQ fue anulada o disminuida. La reparación de las aberraciones cromosómicas inducidas por mitomicina-C se vio afectada in vitro en células somáticas humanas y de ratón RAD51B/Rad51b-c.92delT y en células de médula ósea de ratón explantadas. En consecuencia, la variante RAD51B-c.92delT redujo la eficiencia de reprogramación pluripotente de los fibroblastos embrionarios de ratón primarios. Finalmente, los ratones Rad51bc.92delT/c.92delT mostraron una mayor incidencia de hiperplasia de la glándula pituitaria. Estos resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre el mecanismo del papel de RAD51B no solo en la meiosis sino también en el mantenimiento de la estabilidad del genoma somático. Los elementos ultraconservados son secuencias genómicas que muestran niveles extremadamente altos de similitud entre especies distantes. Hasta la fecha, no se ha propuesto ninguna explicación funcional convincente que resulte en un nivel tan alto de conservación. Sin embargo, la distribución de estos elementos dentro y entre los genomas de vertebrados sugiere que podrían tener muchas funciones como elementos reguladores de la transcripción durante la diferenciación asociada con el desarrollo. Para explorar directamente un papel funcional de estos elementos ultraconservados en la regulación de la espermatogénesis, se han seleccionado dos elementos ultraconservados, HS205 y HS1442, potencialmente involucrados en la biología de las células germinales según su actividad potenciadora restringida durante el desarrollo del ratón hasta el tubérculo genital. Con el fin de analizar su papel, se ha caracterizado su actividad potenciadora tanto in vitro en diferentes tipos de células como in vivo mediante electroporación testicular. Además, se ha eliminado hs205 y hs1442 en el ratón utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y analizado sus consecuencias durante la espermatogénesis. Los resultados proporcionan evidencia in vivo de que HS205 y HS1442 no son esenciales para la gametogénesis masculina y, por lo tanto, para la fertilidad en el ratón.