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Título
Mechanisms of activation of the guanine nucleotide exchange factor C3G
Autor(es)
Director(es)
Materia
Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Polipéptidos
Estructura molecular
Nucleótidos
Citología
Epitelioma
Clasificación UNESCO
2407 Biología Celular
Fecha de publicación
2023
Resumen
[EN] C3G (also known as RapGEF1) is a ubiquitously expressed guanine nucleotide exchange factor (GEF) that activates mainly the small GTPase Rap1 to promote integrin-mediated cell adhesion. C3G also regulates cell migration, actin remodeling, proliferation, apoptosis, differentiation, and exocytosis. C3G is a modular protein with three structurally and functionally distinct regions. The N-terminal domain (NTD) interacts with E-cadherin and participates in the self-regulation of C3G. The central or SH3b region is mostly flexible and is involved in protein-protein interactions. This region contains five proline-rich motifs (PRMs), P0 to P4, which are binding sites for SH3 domains. The Crk and CrkL adaptor proteins bind to four of these sites (P1, P2, P3 and P4). The C-terminal part contains a REM and a Cdc25H domain that form the catalytic region. The GEF activity of C3G is regulated by two intramolecular interactions. First, binding of the NTD to the REM domain contributes positively to the activity of C3G. Secondly, the C-terminal segment of the SH3b downstream the P3 is an autoinhibitory region (AIR) that binds to the Cdc25HD and blocks the GEF activity. C3G is physiologically activated in response to stimuli that operate through the activation of tyrosine kinases. These signals induce the recruitment of C3G to signaling sites at the membrane, which is mediated by Crk proteins. Activation of the GEF activity of C3G involves tyrosine phosphorylation by Src family and other kinases, and the interaction with Crk proteins. Despite the general processes involved in C3G activation were known, the detailed mechanisms were poorly understood. In this Thesis, we have combined biochemical, biophysical and cell biology approaches to gain understanding of the structural and mechanistic basis of the autoinhibition and physiological activation mechanism of C3G activation within the C3G-Rap1 pathway. We have demonstrated that CrkL binds differentially to the PRMs P1, P2, P3 and P4 in full-length C3G. In resting conditions, sites P1 and P2 are constitutively fully accessible. Exposure of the P3 site is linked to the activation state of C3G. The P4 site is partially accessible independently of the activation state of C3G. The sites P1 and P2 do not participate in the direct activation of C3G. Instead, these sites participate in the constitutive interaction with Crk proteins in HEK293T and Jurkat cell lines, and are required for the recruitment of C3G to the plasma membrane upon TCR stimulation of Jurkat cells. Binding of CrkL to the P3 and P4 is required and sufficient for the direct activation of C3G by CrkL through the release of the autoinhibitory interaction. Binding of CrkL to the P3 is the main activation event. Collectively, P1 and P2 are recruitment sites and P3 and P4 are activation sites. Tyrosine phosphorylation of C3G alone causes minimal activation, yet it is essential for the Crk-mediated stimulation. Phosphorylation by Src sensitizes C3G, which is activated at lower concentrations of CrkL and to higher activity levels than unphosphorylated C3G. We have mapped the main Src phosphorylation sites in C3G at Y329, Y504, Y579 and Y590. Despite CrkL interacts with the P3 and P4 primarily by the SH3N domain, the SH2 and SH3C domains of CrkL also contribute to the activation of C3G. In particular, the SH2 domain plays a key role in the activation of phosphorylated-C3G through a non-canonical low affinity interaction with phospho-Y590, which apparently stabilizes the interaction of CrkL with the activation sites. We have also shown that CrkL induces a stronger activation of C3G than CrkII, and these differences are apparently due to the different inter-domain arrangements of Crk proteins. We have also produced an experimentally validated structural model of autoinhibited C3G, which revealed additional contacts of the AIR with the REM domain. Based on the results, propose a multi-step cycle for the physiological activation and de-activation of C3G. Finally, we have applied the structural and functional data to identify three cancer somatic missense mutations that cause constitutive activation of C3G: Y570N and Y590N were found in non-Hodgkin lymphoma patients, and Y579C was described in a thyroid carcinoma. These mutations expand the repertoire of acquired alterations that deregulate C3G-Rap1 in cancers. In summary, the results of this Thesis contribute to understand the mechanisms of C3G-Rap1 signaling in healthy tissues and in diseases.
[ES] C3G (RapGEF1) es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) expresado de forma ubicua que activa principalmente la pequeña GTPasa Rap1 promoviendo la adhesión celular mediada por integrinas. C3G también regula migración celular, remodelación de actina, proliferación, apoptosis, diferenciación y exocitosis. C3G es una proteína modular con tres regiones estructural y funcionalmente diferenciadas. El dominio N-terminal (NTD) interacciona con E-cadherina y participa en la autorregulación de C3G. La región central o SH3b es mayoritariamente flexible y participa en las interacciones proteína-proteína. Esta región contiene cinco motivos ricos en prolina (PRM), P0 a P4, que son sitios de unión para dominios SH3. Las proteínas adaptadoras Crk y CrkL se unen a cuatro de estos sitios (P1, P2, P3 y P4). La zona C-terminal contiene un dominio REM y un dominio Cdc25H que forman la región catalítica. La actividad GEF de C3G está regulada por dos interacciones intramoleculares. En primer lugar, la unión del NTD al dominio REM contribuye positivamente a la actividad de C3G. En segundo lugar, el segmento C-terminal de SH3b tras el P3 es una región autoinhibitoria (AIR) que se une al Cdc25HD y bloquea la actividad del GEF. C3G se activa fisiológicamente en respuesta a estímulos que operan mediante la activación de tirosina quinasas. Estas señales inducen el reclutamiento de C3G a sitios de señalización en la membrana, este proceso está mediado por proteínas Crk. La activación de la actividad GEF de C3G implica su fosforilación en tirosina quinasas de la familia Src y otras quinasas, y la interacción con las proteínas Crk. A pesar de que se conocían los procesos generales implicados en la activación de C3G, los mecanismos detallados no se comprendían bien. En esta Tesis, hemos combinado enfoques bioquímicos, biofísicos y de biología celular para caracterizar las bases estructurales y mecanísticas de los mecanismos de autoinhibición y activación fisiológica de la activación de C3G dentro de la vía C3G-Rap1. Hemos demostrado que CrkL se une de manera diferencial a los PRMs P1, P2, P3 y P4 en C3G completo. En condiciones de reposo, los sitios P1 y P2 están constitutiva y totalmente accesibles. La exposición del sitio P3 está relacionada con el estado de activación de C3G. El sitio P4 está parcialmente accesible independientemente del estado de activación de C3G. Los sitios P1 y P2 no participan en la activación directa de C3G. En cambio, estos sitios median la unión constitutiva con las proteínas Crk en las líneas celulares HEK293T y Jurkat, y son necesarios para el reclutamiento de C3G a la membrana plasmática tras la estimulación de TCR en células Jurkat. La unión de CrkL a P3 y P4 es necesaria y suficiente para la activación directa de C3G por CrkL causando la liberación de la interacción autoinhibitoria. La unión de CrkL al P3 es el principal evento de activación. Colectivamente, P1 y P2 son sitios de reclutamiento y P3 y P4 son sitios de activación. La fosforilación de C3G en tirosinas por sí sola causa una activación mínima, pero es esencial para la estimulación mediada por Crk. La fosforilación por Src sensibiliza a C3G, que se activa a concentraciones más bajas de CrkL y a niveles de actividad más altos que cuando C3G no está fosforilado. Hemos mapeado los principales sitios de fosforilación de Src en C3G, resultando en Y329, Y504, Y579 e Y590. A pesar de que CrkL interactúa con P3 y P4 principalmente mediante el dominio SH3N, los dominios SH2 y SH3C de CrkL también contribuyen a la activación de C3G. En particular, el dominio SH2 juega un papel clave en la activación de C3G fosforilado a través de una interacción no canónica de baja afinidad con fosfo-Y590, la cual aparentemente estabiliza la interacción de CrkL con los sitios de activación. También hemos demostrado que CrkL induce una activación más fuerte de C3G que CrkII, y estas diferencias parecen deberse a la diferente organización entre-dominios de las proteínas Crk. También hemos producido un modelo estructural validado experimentalmente de C3G autoinhibido, que reveló contactos adicionales del AIR con el dominio REM. En base a los resultados, proponemos un ciclo multi-etapa de la activación y desactivación fisiológica de C3G. Finalmente, hemos aplicado los datos estructurales y funcionales para identificar tres mutaciones somáticas de cambio de sentido en cáncer que causan la activación constitutiva de C3G: Y570N e Y590N están descritas en pacientes con linfoma no Hodgkin, y Y579C se había detectado en un carcinoma de tiroides. Estas mutaciones amplían el repertorio de alteraciones adquiridas que desregulan C3G-Rap1 en tumores. En resumen, los resultados de esta Tesis contribuyen a comprender los mecanismos de señalización de C3G-Rap1 en tejidos sanos y en enfermedades.
URI
DOI
10.14201/gredos.157727
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