Estudio de los receptores y mecanismos de entrada de los paramixovirus: virus respiratorio sincitial y virus de la enfermedad de Newcastle

Abstract

[ES] Los paramixovirus son virus RNA (-), responsables de diferentes enfermedades en humanos y animales. Concretamente, el Virus Respiratorio Sincitial (RSV) provoca al año la muerte de entre 77.000 y 200.000 niños y la hospitalización de más de 20 millones de individuos. Actualmente no se posee ni vacuna ni tratamiento eficaz. Por su parte, el Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV) provoca importantes pérdidas económicas en granjas avícolas.

El ciclo de vida de los paramixovirus comienza con la interacción del virus con la célula hospedadora. Las proteínas de unión del virus reconocen receptores específicos de la superficie celular. Estas proteínas con la proteína G en el caso del RSV y la proteína HN en el caso de NDV. El segundo paso consiste en la fusión de las membrana vírica y celular, lo cual se produce gracias a la actividad fusogénica de la proteína F (de fusión) del virus. Este paso resulta crítico para la entrada del virus ya que bien se puede producir por fusión directa a nivel de la membrana citoplasmática, o bien el virus puede penetrar mediante endocitosis y fusionar posteriormente con las membranas endocíticas. Ambos mecanismos acaban produciendo la liberación del genoma vírico en el citoplasma celular donde podrá generar nuevos viriones.

Actualmente se desconocen los mecanismos concretos que regulan el reconocimiento del receptor y fusión de membranas de los paramixovirus, y concretamente del Virus Respiratorio Sincitial (RSV), con la membrana de la célula diana. En los últimos años se ha profundizado en el estudio de los mecanismos de endocitosis, viéndose que muchos virus la utilizan ya sea en exclusividad o complementariamente a la fusión directa con la membrana plasmática, cómo es el caso del RSV y NDV.

El conocimiento de los receptores específicos y de los mecanismos concretos de entrada de estos virus permitirá establecer las estrategias en el desarrollo de terapias antivíricas. Esto es especialmente importante ya que se carece de tratamientos específicos para la infección por RSV, limitándose a tratamientos paliativos, y puede ayudar al desarrollo de nuevas terapias frente al RSV.

Los objetivos abordados fueron:

Objetivo 1.- Identificar los receptores de los paramixovirus, RSV y NDV, de la superficie de la célula hospedadora.

Hemos utilizado diferentes inhibidores de la glicosilación de proteínas con el fin de conseguir caracterizar el tipo de residuos que forman parte de las proteínas receptoras celulares del RSV. El RSV precisa receptores O-glicosilados para la entrada en la célula diana y la O-glicosilación y N-glicosilación para la correcta maduración de las proteínas de los nuevos viriones. En el caso del NDV, nuestros datos indican que el remodelado del patrón de glicolípidos de la membrana diana mediante la expresión de sialidasas de mamífero disminuye la fusión e infectividad víricas. Además, mediante la técnica de VOPBA se aislaron las proteínas receptoras específicas de cada virus, para su posterior secuenciación e identificación. Hemos visto que el NDV interacciona con la Proteína Disulfuro Isomerasa (56kDa), y que el RSV interacciona con proteínas de 28 y 55 kDa

Objetivo 2.- Estudiar el efecto del pH y la temperatura sobre la fusión de los paramixovirus con células de cultivo.

Nuestros datos muestran que los tratamientos a pH ácido incrementan la cinética de la fusión del RSV, si bien no se ve ningún aumento de la fusión a tiempos largos. Esto podría ser debido a que el pH este facilitando un cambio conformacional de la proteína F que no ocurre in vivo. En el caso del NDV los tratamientos a pH ácido provocan una disminución en la cinética de fusión aunque hay aumento global de la fusión a pH ácido.

Objetivo 3.- Analizar la entrada del NDV y RSV por mecanismos endocíticos.

Los tratamientos con diferentes inhibidores de la endocitosis y experimentos de colocalización nos indicaron que el NDV la utilizaría como mecanismo accesorio de entrada en la célula diana. En el caso del RSV existe controversia acerca de si el RSV utilizaría la ruta endocítica; nuestros datos parecen apoyar que el RSV no utilizaría dicho mecanismo de entrada.

Objetivo 1.- Identificar los receptores de los paramixovirus, RSV y NDV, de la superficie de la célula hospedadora. 1.- Los GAGs se encuentran unidos a glicoproteínas. Por ello utilizamos diferentes inhibidores de la síntesis de glicoproteínas: tunicamicina y desoximanojirimicina, inhibidores de la N-glicosilación; y BenzilGalNAc como inhibidor de la O-glicosilación. El efecto de la glicosilación se determinó estudiando la fusión célula-célula (transferencia de sondas fluorescentes), la formación de sincitios, la infectividad (inmunofluorescencia) y el grado de unión del virus a la célula (citometría de flujo). 2.- Para ampliar el conocimiento del papel de los acidos sialicos en la unión y fusión del NDV con la célula hospedadora, sobreexpresamos la sialidasa NEU3 mediante transfección transitoria. Con ello modificamos el patrón de gangliósidos (sialoglicolípidos) de la membrana de la célula diana. Observamos cómo ello afecta a la fusión virus-célula y a su infectividad, mediante microscopía de fluorescencia. 3.- El tercer grupo de experimentos consistió en realizar diferentes pruebas de VOPBA. Esta técnica analiza la interacción in vitro del virus con proteínas transferidas a una membrana de PVDF. Las proteínas positivas se secuenciaron y caracterizaron por espectrofotometría de masas.

Objetivo 2.- Estudiar el efecto del pH y la temperatura sobre la fusión de los paramixovirus con células de cultivo.

El efecto del pH y la temperatura en la fusión se analizó mediante diferentes aproximaciones: 1.- En primer lugar se midió la fusión de los virus marcados con la sonda octadecil-rodamina (RSV-R18 y NDV-R18) con células en cultivo y con envolturas reconstituidas de eritrocitos (ghosts). En estos experimentos se analizó el efecto del pH sobre la cinética de la fusión (técnicas fluorimétricas) y el número de células positivas para la señal de rodamina (microscopía de fluorescencia). También se sometió a células preinfectadas con RSV a diferentes pulsos de pH ácido y se analizó cómo afecta dicho pH a la actividad de las proteínas víricas expresadas en la superficie de las células. La infectividad se analizó midiendo la formación de sincitios y mediante inmunofluorescencia. La infectividad de virus preincubados a pH ácido se cuantificó mediante recuento de sincitios e inmunofluorescencia.

Objetivo3.- Analizar la entrada del NDV y RSV por mecanismos endocíticos.

Para comprobar si estos virus utilizan estas rutas de entrada se trataron células de cultivo con diferentes inhibidores de la endocitosis. El efecto de los tratamientos sobre la entrada de los virus se analizó mediante citometría de flujo, inmunofluorescencia, recuento de sincitios y microscopía confocal. Los inhibidores utilizados fueron los siguientes: 1.- Bisindolilmaleimida: inhibidor de la proteína kinasa C necesaria para la endocitosis mediada por receptor. 2.- Dinasore: Inhibidor de la actividad GTPasa de la dinamina 1, inhibe la endocitosis de mediada por clatrina y también por caveolas. 3.- Concanamicina A: Inhibidor de la ATPasa vacuolar necesaria para producir la bajada de pH que permita entrar en las células a virus que requiren pH ácido. 4.- Monensina: Ionóforo que previene la acidificación del endosoma y por tanto inhibe la entrada de virus que requieren pH ácido. 5.- Cloroquina: Es un agente lisosomotrópico que alcaliniza las vesículas endocíticas. 6.- Nocodazol: Despolimeriza los microtúbulos 7.- Metil-beta-ciclodextrina: Agente que secuestra selectivamente colesterol de las membranas en inhibe la formación de vesículas rodeadas de clatrina y endocitosis mediada por caveolas. 8.- PMA: Compuesto inhibidor de la endocitosis mediada por caveolas al fosforilar caveolina. 9.- Nistatina: Antibiótico que se une a esteroides, inhibe la endocitosis mediada por caveolas al eliminar colesterol de la membrana. 10.- Clorpromacina: Compuesto catiónico anfipático que inhibe el reciclado de clatrina y por tanto la endocitosis mediada por esta proteína.

Conclusiones: 1. La interacción del NDV con gangliósidos GD1a determina la infección productiva del NDV. El GD1a es un receptor determinante de la célula a infectar. 2. El NDV interacciona in vitro con la Proteina Disulfuro Isomerasa A3. 3. El NDV muestra un movimiento organizado y dirigido en la superficie de células HeLa, movimiento que depende del citoesqueleto. 4. Las proteínas del NDV colocalizan con marcadores de endosomas tempranos a los 30 min postinfección. 5. El NDV puede entrar en la célula huésped mediante endocitosis mediada por caveolas, ya que los inhibidores de esta ruta afectan a la formación de sincitios, a la infectividad del NDV y a la colocalización con endosomas tempranos. 6. La O-glicosilación de las proteínas de la membrana diana del RSV es esencial para la unión, fusión del virus con la célula y la formación de sincitios. 7. El grado de N-glicosilación de las proteínas de la membrana diana del RSV no afecta a la unión ni a la fusión directa del RSV con la célula diana, mientras que la N-glicosilación es esencial para la maduración e infectividad de la progenie. 8. El RSV interacciona in vitro con proteínas diferentes a los proteoglicanos como la nucleolina. 9. El pH ácido activa la fusión del RSV con células de cultivo. 10. El RSV utiliza mecanismos de entrada endocíticos no dependientes de clatrina.

[EN] The paramyxoviruses are RNA virus (-), responsible for different diseases in humans and animals. Specifically, Respiratory Syncytial Virus (RSV) causes death year between 77,000 and 200,000 children and hospitalization of more than 20 million individuals. Currently not own or vaccine or effective treatment. Meanwhile, the Disease Virus (NDV) causes significant economic losses in poultry.

The life cycle begins with paramyxoviruses interaction of the virus with the host cell. The virus binding proteins recognize specific receptors on the cell surface. These proteins with protein G in the case of RSV and the HN protein of NDV in the case. The second step consists in the fusion of the viral and cellular membranes, which is produced by the fusogenic activity of the protein F (fusion) of the virus. This step is critical for viral entry as well can be produced by direct fusion to the cytoplasmic membrane level, or the virus can penetrate through endocytosis and subsequently fuse with endocytic membranes. Both ends up causing the release mechanisms of the viral genome into the cell cytoplasm where they can generate new virions.

Currently unknown mechanisms which regulate specific receptor recognition and fusion of membranes of paramyxoviruses, specifically Respiratory Syncytial Virus (RSV), with the target cell membrane. In recent years there has been studied in depth endocytosis mechanisms, seeing the many virus used either exclusively or in addition to direct fusion with the plasma membrane, such as RSV and NDV.

Knowledge of specific receptors and specific mechanisms of entry of these viruses will establish strategies in developing antiviral therapies. This is especially important because it has no specific treatment for RSV infection, limited to palliative treatments, and may help develop new therapies against RSV.

The objectives were addressed:

Purpose 1. - Identify receptors paramyxoviruses, RSV and NDV, the surface of the host cell.

We used different inhibitors of protein glycosylation to achieve characterize the type of waste which are part of cell receptor proteins of RSV. The precise RSV O-glycosylated receptors for entry into the target cell and the O-glycosylation and N-glycosylation for proper maturation of the protein of new virions. For NDV, our data indicate that the glycolipid remodeling pattern of the target membrane by expression of mammalian sialidases decreases viral fusion and infectivity. Furthermore, using the technique of VOPBA receptor proteins were isolated specific virus for subsequent sequencing and identification. We have seen that the NDV interacts with the protein disulfide isomerase (56kDa), and that interacts with RSV proteins of 28 and 55 kDa

Objective 2. - Studying the effect of pH and temperature on the paramyxovirus fusion with cultured cells.

Our data show that treatments to increase the acid pH kinetics of RSV fusion, while not see any increase in long melting times. This may be because the pH of this conformational change facilitating the F protein that occurs in vivo. In the case of NDV at acidic pH treatments cause a decrease in fusion kinetics although no overall increase melting at acidic pH.

Objective 3. - Analyze the NDV and RSV entry by endocytic mechanisms.

Treatments with various endocytosis inhibitors and colocalization experiments indicated that the NDV us used as the attachment mechanism of entry into the target cell. In the case of RSV controversy exists about whether RSV use the endocytic pathway, our data seem to support that RSV would not use the input mechanism.

Purpose 1. - Identify receptors paramyxoviruses, RSV and NDV, the surface of the host cell. 1. - GAGs are attached to glycoproteins. We therefore use various inhibitors of the synthesis of glycoproteins: desoximanojirimicina tunicamycin and inhibitors of the N-glycosylation, and BenzilGalNAc as inhibitor of O-glycosylation. The effect of glycosylation was determined by studying the cell-cell fusion (transfer fluorescent probes), syncytia formation, infectivity (immunofluorescence) and degree of virus binding to the cell (flow cytometry). 2. - To raise awareness about the role of sialic acids in the binding and fusion with the host cell NDV, sialidase NEU3 overexpressed by transient transfection. This modified pattern gangliosides (sialoglicolípidos) of the target cell membrane. Note how this affects the virus-cell fusion and infectivity by fluorescence microscopy. 3. - The third set of experiments consisted VOPBA perform different tests. This technique analyzes the virus in vitro interaction with proteins transferred to a PVDF membrane. Positive proteins were sequenced and characterized by mass spectrometry.

Objective 2. - Studying the effect of pH and temperature on the paramyxovirus fusion with cultured cells.

The effect of pH and temperature in the melt was analyzed using different approaches: 1. - First fusion was measured viruses probe labeled with octadecyl rhodamine (RSV-NDV-R18 and R18) with cultured cells and reconstituted envelopes of erythrocytes (ghosts). In these experiments we examined the effect of pH on the kinetics of fusion (fluorimetric techniques) and the number of cells positive for rhodamine signal (fluorescence microscopy). Also underwent preinfectadas cells pulsed with different RSV to acid pH and analyzed as said pH affects the activity of viral proteins expressed on the surface of cells. Infectivity was assayed by measuring the formation of syncytia and by immunofluorescence. The infectivity of virus preincubated at acid pH was quantified by counting of syncytia and immunofluorescence.

Objective 3. - Analyze the entrance of NDV and RSV by endocytic mechanisms.

To check whether these viruses use these input paths culture cells were treated with various inhibitors of endocytosis. The effect of the treatments on entry of the virus was analyzed by flow cytometry, immunofluorescence, syncytia counted and confocal microscopy. The inhibitors used were: 1. - Bisindolylmaleimide: inhibitor of protein kinase C necessary for receptor-mediated endocytosis. 2. - Dinasore: Inhibitory activity of the GTPase dynamin 1, inhibits clathrin-mediated endocytosis and also by caveolae. 3. - Concanamycin A: vacuolar ATPase inhibitor required to produce the lowering of pH which allows cells to enter viruses that require acidic pH. 4. - Monensin: Ionophore preventing endosome acidification and therefore inhibiting the entry of viruses that require acidic pH. 5. - Chloroquine is an alkaline agent that lisosomotrópico endocytic vesicles. 6. - Nocodazole: microtubule depolymerisation 7. - Methyl-beta-cyclodextrin: cholesterol agent that sequesters selectively inhibits the membranes in vesicle formation of clathrin surrounded and caveolae-mediated endocytosis. 8. - PMA: Composite inhibitor caveolae-mediated endocytosis to phosphorylate caveolin. 9. - Nystatin: antibiotic that binds steroid inhibits caveolae-mediated endocytosis to remove cholesterol from the membrane. 10. - Chlorpromazine cationic amphipathic compound which inhibits recycling and therefore clathrin-mediated endocytosis this protein.

Conclusions: 1. The interaction of the ganglioside GD1a determines NDV productive infection of NDV. The receiver GD1a is a determinant of cell infected. 2. The NDV interacts in vitro with the protein disulfide isomerase A3. 3. The NDV shows an organized and directed movement on the surface of HeLa cells, cytoskeleton-dependent movement. 4. NDV proteins colocalize with early endosomes markers at 30 min after infection. 5. NDV can enter the host cell through caveolae-mediated endocytosis, and that inhibitors of this pathway affecting the formation of syncytia, the infectivity of NDV and colocalization with early endosomes. 6. The O-glycosylation of the target membrane proteins of RSV is essential for binding of virus fusion with the cell and the syncytia formation. 7. The extent of N-glycosylation of the target membrane proteins of RSV does not affect the binding or direct fusion with the target cell RSV, whereas N-glycosylation is essential for maturation and infectivity of the progeny. 8. RSV in vitro interacts with different proteins as nucleolin proteoglycans. 9. The activated acid pH RSV fusion culture cells. 10. The RSV uses input mechanisms not dependent endocytic clathrin.