Caracterización funcional de las proteínas Executer en la señalización plastídica mediada por oxígeno singlete

Abstract

[ES] Las proteínas cloroplastídicas Executer se han propuesto como candidatas en la señalización del cloroplasto al núcleo desencadenada por el oxígeno singlete generado en el cloroplasto (Wagner et al. 2004. Science). A partir de estudios genómicos, se sugirió que Executer1 (Ex1) está directamente involucrada en la transmisión de la información, mientras que Executer2 (Ex2) modula negativamente la función de Ex1 (Lee et al. 2007. PNAS). Se ha propuesto que Ex2 ejecuta su función mediante una interacción física con Ex1, aunque hasta la fecha aún no se ha demostrado tal interacción. Aunque no se observaron diferencias fenotípicas en plantas mutantes con pérdida de función de Ex1 y de Ex2 en comparación con las silvestres, sí se ha detectado que estas plantas muestran una aclimatación al estrés dependiente de Executer en hojas roseta (Wagner et al. 2004. Science; Ramel et al. 2012. PNAS; Mur et al. 2010. New Phytol). El objetivo principal de esta tesis es la caracterización funcional de estas proteínas. En este trabajo se presenta un análisis evolutivo de las proteínas de la familia Executer en el que muestra que esta familia de proteínas se encuentra exclusivamente en plantas verdes, y que su expansión tuvo lugar con la aparición de las espermatofitas. La función de Ex1 y Ex2 está asociada con órganos fotosintéticos de Arabidopsis thaliana según los resultados obtenidos a partir de la cuantificación relativa de PCR a tiempo real y de la tinción histoquímica de plantas transgénicas que expresan el gen reportador beta-glucuronidasa (GUS) bajo el control del promotor de Ex1 y de Ex2. Nuestro estudio confirma la localización cloroplastídica mediante microscopía confocal y demuestra la asociación con plastoglóbulos, cuerpos lipídicos con proteínas asociados a las membranas tilacoidales. La expresión diferencial de las proteínas solubles del cloroplasto en plantas mutantes ex1 y ex2 respecto a las plantas silvestres después de un tratamiento con alta intensidad de luz se analizó mediante una aproximación proteómica 2D-DIGE (electroforesis bidimensional diferencial). Las proteínas diferencialmente expresadas en plantas silvestres después de la exposición a la alta intensidad de luz participan principalmente en la fotosíntesis y en el metabolismo del carbono, siendo esta respuesta muy similar a la encontrada en las plantas mutantes en condiciones normales de luz. Estos resultados sugieren que las proteínas Executer participan en la señalización basal en cloroplastos y en la regulación de la respuesta a la aclimatación a la luz. El estudio comparativo de secuencias muestra que las proteínas son bimodulares con características de proteínas intrínsecamente desordenadas, típicas de proteínas involucradas en señalización. Nuestros resultados no han demostrado una interacción estable entre Ex1 y Ex2 en células de tabaco bajo condiciones normales de crecimiento. Nuestros análisis sugieren que el módulo N-terminal tanto de Ex1 como de Ex2 está implicado en la formación de homodímeros, y que esta interacción está favorecida frente a la formación de heterodímeros Ex1-Ex2.