Stevia rebaudiana Bertoni cultivated in the field and obtained by in vitro micropropagation: A prospective study of the antioxidant potential in different culture and storage conditions

Abstract

La realización de estudios con condiciones de cultivo bien establecidas es de extrema importancia para estandarizar la producción de plantas y, por lo tanto, su composición química. Sin embargo, las condiciones de conservación también pueden influir sobre los compuestos bioactivos presentes en la mismas. En el presente trabajo, muestras de Stevia rebaudiana Bertoni (estevia) cultivadas en el noreste de Portugal fueron sometidas a dos condiciones de conservación diferentes: secado en invernadero a 30 °C y congelación en fresco a -20 °C, y posteriormente almacenadas durante seis días. Por otra parte, para definir las mejores condiciones de cultivo y maximizar los niveles de compuestos bioactivos, se evaluó también el efecto de diferentes concentraciones de nitrógeno (N) sobre la composición química y las propiedades antioxidantes de las hojas frescas y secas congeladas de estevia. En todos los casos, las muestras fueron caracterizadas en cuanto a cuantificación e identificación de azúcares libres, tocoferoles y compuestos fenólicos, y determinación del potencial antioxidante mediante ensayos de captación del radical DPPH y poder reductor (RP) de sus extractos metanol:agua. Los azúcares más abundantes en las muestras estudiadas fueron xilosa, arabinosa + fructosa y sacarosa, mientras que los principales compuestos fenólicos fueron los derivados del ácido cafeico, ácido 5-O-cafeoilquínico (ácido clorogénico) y ácido 3,5-O-dicafeoilquínico. Las muestras secadas en invernadero dieron lugar a valores más elevados de actividad antioxidante y de compuestos fenólicos totales que las mantenidas a -20 ºC. Sin embargo, las muestras frescas congeladas presentaron contenidos más altos de tocoferoles y de azúcares totales. Se pudo comprobar que el proceso de conservación afectaba más significativamente los valores de tocoferoles y de contenido de azúcares que la fertilización con N. En general, la fertilización con N conducía a una mejora en la composición química y el potencial bioactivo de las hojas de estevia. Los mayores niveles de compuestos fenólicos se encontraron en las muestras secas y en aquellas fertilizadas con 25 kg de N/ha. Las hojas de plantas fertilizadas con 25 y 50 kg N/ha también fueron las que evidenciaron mayor actividad antioxidante, que parecía estar especialmente determinada por la composición fenólica. Los reguladores del crecimiento de las plantas, que controlan los procesos fisiológicos en células especializadas, se utilizan en el desarrollo de cultivos de plantas in vitro. Por ello, se estudió también la composición en azúcares libres, tocoferoles y compuestos fenólicos y el potencial antioxidante en hojas de estevia obtenidas por cultivo in vitro con y sin cinetina (fitorregulador). Las muestras cultivadas sin cinetina evidenciaron una mayor concentración de tocoferoles totales y de compuestos fenólicos que las obtenidas en presencia de cinetina. Por lo contrario, se observó una tendencia opuesta para los azúcares libres totales. Los extractos de metanol:agua obtenidos de muestras cultivadas sin cinetina también evidenciaron mayor actividad captadora de radicales y poder reductor que los de las muestras cultivadas en presencia de cinetina, lo que parece confirmar la relación de este fitorregulador con la producción de compuestos fenólicos. En general, el cultivo in vitro es una forma eficaz de obtener biomasa vegetal que pueda ser utilizada como fuente de compuestos antioxidantes de manera continua y sin estar sometida a condiciones edafoclimáticas. Sin embargo, a las dosis ensayadas el empleo de cinetina, aunque mejoró la tasa de multiplicación, no condujo a una mayor acumulación de moléculas bioactivas, por lo que se deberían ensayar otros niveles de aplicación de este regulador, así como otras hormonas para establecer su influencia sobre la producción de este tipo de compuestos. El estudio realizado proporciona evidencias para elegir la metodología más apropiada para favorecer la acumulación y preservar los niveles de metabolitos primarios y secundarios de Stevia rebaudiana relacionados con su actividad antioxidante.

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Studies with well-established cultivation conditions are of utmost importance in order to standardize plants production and, therefore, its chemical composition. However, the conservation conditions may also have an influence on the bioactive compounds present in those plants. In the present work, Stevia rebaudiana Bertoni samples cultivated in the north-eastern of Portugal were submitted to different conservation conditions (oven-dried at 30 °C, for six days, or kept fresh by freezing (-20 °C) in the same period).

Furthermore, in order to define the best growing conditions to maximize the levels of bioactive compounds, the effect of different nitrogen (N) rates on the chemical composition and antioxidant properties of stevia frozen fresh and dried leaves was also evaluated. All samples were analysed for their content and composition in sugars, tocopherols and phenolic compounds, as well as the free radical scavenging activity (DPPH) and reducing power (RP) of their methanol:water extracts. The most abundant sugars were xylose, arabinose + fructose and sucrose, whereas the main phenolic compounds in all samples were two caffeic acid derivatives, 5-O-caffeoylquinic acid (chlorogenic acid) and 3,5-O-dicaffeoylquinic acid.

Dried samples presented higher contents of antioxidant activity and total phenolic compounds than fresh frozen ones, whereas the highest values of total tocopherols and total sugars were registered in frozen samples. In general, processing affects more significantly tocopherol and sugar contents than N fertilization, although this latter provides an improvement in the chemical composition and bioactive potential of stevia leaves. Greater levels of phenolic compounds were found in dried samples and in those fertilized with 25 kg N/ha. Leaves from plants fertilized with 25 and 50 kg N/ha were also those that evidenced the highest antioxidant activity, which seemed to be influenced by the phenolic composition. Plant growth regulators are used in the development of in vitro plant cultures, controlling the physiological processes in specialized cells. Stevia leaves obtained by in vitro culture with and without kinetin (phytoregulator) were analyzed to compare their composition in free sugars, tocopherols and phenolic compounds, as also to assess the antioxidant activity of their methanol:water extracts. Samples cultured without kinetin evidenced higher concentration in total tocopherols and phenolic compounds than those obtained in the presence of kinetin. Otherwise, an opposite trend was observed for total free sugars.

Methanol:water extracts obtained from samples cultured without kinetin also evidenced higher radical scavenging activity and reducing power than those cultured in the presence of kinetin, which seems to confirm the relationship between the antioxidant activity and the content of phenolic compounds. Overall, in vitro culture can be used as an efficient way to produce plant sources of antioxidant compounds, but other hormones besides kinetin should also be tested so as to check their ability to improve the production of bioactive molecules.

This study gives clues to select the most appropriate methodology to enhance and preserve primary or secondary metabolites involved in the antioxidant activity of Stevia rebaudiana.